Простой метод для размера контролируемого синтеза стабильных олигомерных кластеров наночастиц золота в условиях окружающей среды

Общая цель данной процедуры — получение олигомерных кластеров наночастиц золота, которые характеризуются высокой стабильностью, легкостью дериватизации и строго контролируемым диаметром; они синтезируются путем восстановления хлорозотистой кислоты тиоцианатом натрия. Частицы, которые мы рассматриваем сегодня, представляют особый интерес из-за высокой точности контроля их размера, что позволяет использовать их для изучения проницаемости мембран для частиц различного размера. Поскольку они очень стабильны в биологических растворах, это свойство делает данные частицы крайне эффективным инструментом.

Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет осуществлять хорошо контролируемый синтез высококачественных олигокластеров золота в стандартных лабораторных условиях с использованием обычного лабораторного оборудования и ограниченного числа реагентов. После приготовления всех необходимых растворов согласно текстовому протоколу начните синтез олигокластеров золота с использованием метода задержки времени, добавив 7 мл раствора буры в чистую стеклянную бутыль объемом 125 мл, содержащую 59,5 мл воды, при перемешивании. Затем добавьте в бутыль 2,8 мл раствора хлорида золота; с этого момента начинается отсчет времени задержки, которое определяет размер олигокластеров.

По истечении периода ожидания добавьте в бутыль 700 µL раствора тиоцианата натрия. Продолжайте перемешивание в течение ночи до полного завершения синтеза олигокластеров. При выполнении данной процедуры важно быстро добавлять хлорид золота и раствор тиоцианата натрия ко всем реагентам при использовании больших объемов данного раствора, используя диспенсеры с широким горлышком.

Для дополнительного роста объедините 10 milliliters золотых олигокластеров с 60 milliliters раствора гидроксилированного хлорида золота. Затем при интенсивном перемешивании добавьте 900 microliters раствора тиоцианата натрия. Перемешивайте смесь в течение ночи до полного завершения реакции.

Перед дериватизацией добавьте 70 мл неочищенных олигокластеров в центрифужный фильтр с порогом отсечения 30 кДа и центрифугируйте в течение 15 минут при 3 000 ×g. Соберите ретентат, перевернув фильтр и центрифугируя его в течение 3 минут при 500 ×g. Затем измерьте объем полученного ретентата с помощью микропипетки.

Затем добавьте объем GSH, равный одной девятой от объема восстановленных олигокластеров. Выдержите реакционную смесь при комнатной температуре не более 10 минут. Разбавьте дериватизированные олигокластеры в 50 миллилитрах фосфатно-солевого буфера Дульбекко, чтобы остановить реакцию.

Затем нанесите дериватизированные олигокластеры в центрифужный фильтр с порогом отсечки 30 kilodalton и центрифугируйте в течение 15 минут при 3, 000 ×g. В завершение извлеките ретентат, перевернув фильтр и центрифугируя его в течение трех минут при 500 ×g. Храните дериватизированные глутатионом олигокластеры при температуре 4 °C.

Для анализа сырых олигокластеров методом гель-электрофореза смешайте их с буфером для нанесения в соотношении два к одному. Затем нанесите 30 microliters олигокластеров на готовый полиакриламидный градиентный гель. Проводите электрофорез с использованием трис-глицинового буфера в течение 26 минут при напряжении 200 volts.

Для гель-электрофореза дериватизированных олигокластеров сначала разбавьте их водой в соотношении один к трем. Затем дополнительно разбавьте кластеры буфером для нанесения в соотношении два к одному. Нанесите 10 microliters смеси олигокластеров на готовый полиакриламидный градиентный гель, после чего проведите электрофорез с использованием трис-глицинового буфера в течение 26 минут при напряжении 200 volts.

Для анализа методом просвечивающей электронной микроскопии промойте 20 µL концентрированных олигокластеров 0,5 mL воды и загрузите их в центрифужный фильтр с пределом отсечения 30 kDa объемом 0,5 mL. Центрифугируйте при 14 000 ×g в течение 10 минут. Затем удалите фильтрат из пробирки и ресуспендируйте осадок в 0,5 mL воды.

Повторите промывку еще дважды, а затем разведите олигокластеры водой в 500 раз. После обработки угольной сетки в тлеющем разряде нанесите на нее 0,6 µL олигокластеров и дайте им высохнуть на воздухе в течение 10 минут. В завершение визуализируйте олигокластеры с помощью просвечивающего электронного микроскопа при увеличении 100 000 x и ускоряющем напряжении 80 kV.

Размер золотых олигокластеров, синтезированных с использованием процедур с задержкой по времени и дополнительного добавления, был проанализирован методом гель-электрофореза. Дорожки со второй по четвертую на геле показали, что размер кластеров увеличивается по мере увеличения времени задержки. Дорожки с пятой по восьмую подтверждают, что размер кластеров также увеличивается в зависимости от количества гидроксилированного золота, используемого в процедуре дополнительного добавления.

Для определения диаметра частиц олигокластеров использовали просвечивающую электронную микроскопию. Диаметры рассчитывали путем проведения измерений на изображениях участков сетки размером 50 нанометров на 50 нанометров, содержащих частицы. Был построен график зависимости размера частиц от времени задержки и количества добавляемого гидроксилированного золота.

Затем эти данные были преобразованы в прогностические уравнения для определения диаметров частиц для каждой процедуры. Метод получения золотых кластеров, о котором вы наверняка слышали, основан на гидроксилировании хлорида золота в щелочном растворе. Таким образом, чем сильнее выражено гидроксилирование, тем ниже вероятность образования золотого кластера.

Эта моя новая работа представляет для меня особый интерес, поскольку именно в ней я впервые осознал, что время воздействия щелочи может быть использовано для контроля размера кластеров. При правильном выполнении золотые оликластеры размером от 3 до 70 нанометров могут быть синтезированы менее чем за сутки. Полученные наночастицы стабильны в физиологических буферах и плазме, что делает их пригодными для экспериментов с визуализацией.

Описанные здесь золотые олигокластеры обладают дополнительным преимуществом: их можно концентрировать без предварительной дериватизации, что позволяет использовать агенты для рутизации в меньших объемах.