Растворение динамическая поляризация ядер Инструментарий в реальном времени ферментативной реакции Стоимость Измерения с помощью ЯМР

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы проследить ферментативные процессы в реальном времени с помощью динамической ядерной поляризации, усиленной ядерным магнитным резонансом. Магнитный резонанс в жидком состоянии, усиленный динамической поляризацией ядер, ДНФ, может помочь ответить на ключевые вопросы: как определить, например, скорость ферментативного превращения пары молекул in cell или in vivo без необходимости каким-либо образом изменять эту пару молекул. Установка оборудования для растворения DNP в нашей лаборатории и прибытие сюда доктора Риккардо Бальцана, доктора философии из лаборатории Арно Комментария в Лозанне, является большим шагом вперед в наших исследованиях.

DNP значительно повышает чувствительность экспериментов, которые мы можем проводить на наших ЯМР-спектрометрах с частотой 500 мегагерц. Это оборудование DNP было первым, установленным во Франции, и я хотел бы отметить, что в приведении этого оборудования в эксплуатацию были задействованы все члены нашей команды NMR, и я хотел бы упомянуть, в частности, Гильдаса Берто, нашего инженера-исследователя, и Фатиху Катеб, нашего метрдотеля. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить прямую количественную оценку подложки и ее эндогенных производных в режиме реального времени с временным разрешением в несколько секунд.

Для поляризационного раствора приготовьте два миллилитра 1,12 моляра, меченного углеродом 13 раствора пирувата натрия, легированного 33 миллимоляром радикала TEMPO в объеме дейтерированной воды в соотношении два к одному для наблюдений с углеродом 13. Понизьте температуру динамической ядерной поляризации (DNP) криостата с помощью процедуры охлаждения, нажав кнопку охлаждения в программном интерфейсе криостата. Соберите жидкий гелий в криостате DNP с помощью процедуры наполнения.

Нажмите кнопку заправки в интерфейсе программного обеспечения cryostat. Затем поместите 300 микролитров оптимизированного поляризационного раствора в контейнер для образца, снабженный поляризатором DNP. Заморозьте контейнер с образцом внутри, аккуратно погрузив его в ванну с жидким азотом.

Удалите жидкий азот, который может присутствовать в контейнере для образцов после процедуры замораживания, извлеките контейнер с образцом из ванны с жидким азотом и поверните его вверх дном. Затем вставьте образец в криостат, предварительно вставив контейнер для образцов в держатель для образцов. Затем поместите держатель образца в основную вставку криостата, прежде чем вставлять волновод микроволновой печи в держатель для образцов.

Понизьте температуру криостата, начав процедуру охлаждения по методу Кельвина. Нажмите одну кнопку охлаждения Кельвина в программном интерфейсе криостата. Включите микроволновый источник и облучите образец, нажав кнопку «Микроволны включены» в программном интерфейсе криостата.

Отсоедините коаксиальный кабель канала обнаружения консоли ЯМР от катушки спектрометра, повернув разъем против часовой стрелки на 90 градусов и потянув за него. Подключите коаксиальный кабель канала детектирования к коаксиальному разъему катушки ЯМР криостата. Затем вставьте штекерный разъем кабеля консоли ЯМР в гнездовой разъем катушки ЯМР криостата, обращая внимание на контакт ориентации.

Сильно нажмите и поверните разъем по часовой стрелке на 90 градусов. Измерьте тепловой сигнал ЯМР в твердом состоянии на месте криостата с помощью простой последовательности импульсов-захвата с некалиброванными импульсами с малым углом флипа, повторяющимися с интервалом t, равным пяти минутам. После настройки измерения напишите zg в командной строке программного обеспечения и нажмите Enter на клавиатуре.

После начала процедуры поляризации измерьте усиленный DNP ЯМР-сигнал в твердом состоянии с той же процедурой и в тех же условиях, что и для измерения теплового сигнала. Отсоедините коаксиальный кабель канала обнаружения канала обнаружения консоли ЯМР от катушки ЯМР криостата, повернув разъем против часовой стрелки на 90 градусов и потянув за него. Затем подключите коаксиальный кабель канала детектирования к коаксиальному разъему катушки спектрометра.

Вставьте штекерный разъем кабеля консоли ЯМР в гнездовой разъем катушки спектрометра, обращая внимание на контакт ориентации. Сильно нажмите и поверните разъем по часовой стрелке на 90 градусов. Свежеприготовьте раствор мышечной ЛДГ кролика из расчета одна единица на миллилитр в реакционном буфере с 20 мкг на миллилитр бычьего сывороточного альбумина.

Затем смешайте 478 микролитров реакционного буфера, 2 микролитра раствора LDH и 20 микролитров дейтерированной воды, чтобы обеспечить стабилизацию поля спектрометра или блокировку. Затем поместите объем раствора объемом 500 микролитров в 5-миллиметровую ЯМР-трубку. Подключите передаточную трубку к автоматизированному устройству впрыска, которое отделяет гиперполяризованный раствор от газообразного гелия, используемого для переноса.

Устройство автоматически подает 500 микролитров гиперполяризованного раствора в пробирку с образцом. Перед растворением поместите пятимиллиметровую ЯМР-трубку, содержащую 500 микролитров образца, в изоцентр ЯМР-спектрометра емкостью 11,74 Тесла. Влейте 5 миллилитров дейтерированной воды в растворимый топер бойлера.

Нагнетайте дейтерированную воду и нагрейте ее с помощью резистивной проволоки до тех пор, пока температура не достигнет примерно 180-200 градусов Цельсия, нажав кнопку подготовки нагревателя в программном интерфейсе криостата. Нажмите кнопку «Операции SS» в программном интерфейсе криостата. Затем снимите направляющую для микроволновой печи со вкладыша для растворения.

Сдвиньте вкладыш для растворения вниз в держатель для образцов. Растворительная вставка должна доставать до дна держателя образца и должна быть сильно надавлена, чтобы обеспечить герметичное соединение с контейнером для образца во избежание утечки дейтерированной воды в криостат. Нажмите на аппаратный спусковой крючок, чтобы начать последовательность растворения, заданную по времени последовательность операций пневматических клапанов.

Сразу после растворения инъекционное устройство смешивает 500 микролитров гиперполяризованного раствора с образцом, помещенным в ЯМР-спектрометр. После растворения измерьте гиперполяризованный сигнал ЯМР от образца в спектрометре с помощью серии 10 градусов, измените угол импульсного захвата последовательностей с интервалом в 1,5 секунды, чтобы следить за прогрессией намагниченности подложки и продукта. После настройки измерения напишите zg в командной строке программного обеспечения и нажмите Enter.

Как только намагниченность полностью ослабнет, измерьте тепловой сигнал ЯМР с помощью серии последовательностей импульсного захвата под углом 90 градусов с интервалом примерно в три минуты, что соответствует примерно 3T1. После настройки измерения, напишите zg в командной строке программного обеспечения, нажмите клавишу ввода. Здесь временной ход спектров, полученных из повторяющихся импульсов с углом поворота 10 градусов, показывает чувствительность и временное разрешение метода.

После пиковой идентификации пируватного субстрата и лактатного продукта количественное определение выполняется путем интеграции сигналов метаболитов. Ферментативная активность определяется по временному ходу сигнала продукта путем подгонки с помощью линейной модели. Для валидации измерения одна и та же величина оценивается по начальной скорости реакции, исходя из соотношения сигналов продукта и подложки.

После освоения полное измерение ферментативной активности может быть выполнено примерно за два часа, если оно выполнено правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание того, как получить высокополяризованный субстрат для ЯМР, ввести его в раствор, содержащий фермент, и следить за ферментативной активностью с помощью ЯМР, усиленного ДНФ. При попытке выполнить эту процедуру важно тщательно подготовить ферментативный раствор со свежим ферментом и сосубстратами, а также избегать появления пузырьков воздуха в пробирке с образцом.

С развитием усиленного магнитного резонанса DNP в жидком состоянии исследователи теперь могут изучать поглощение субстрата и его ферментативную трансформацию внутри различных типов клеток, измеряя скорость образования продукта. Не забывайте, что работа с криогенным оборудованием и сильными магнитными полями может быть крайне опасной. При выполнении этих измерений всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты от криогенов и проверка отсутствия магнитных предметов.

В отличие от классического ЯМР, ЯМР на основе растворения ДНФ ограничен экспериментальным временным окном не более нескольких минут, в зависимости от субстрата и текущего состояния жизни. Это препятствует выходу за рамки одной D-спектроскопии. ЯМР растворения ДНФ нуждается в развитии, чтобы довести его до уровня универсальности классического многомерного ЯМР.