Растворение динамическая поляризация ядер Инструментарий в реальном времени ферментативной реакции Стоимость Измерения с помощью ЯМР

Общая цель данного эксперимента заключается в отслеживании ферментативных процессов в режиме реального времени с помощью ядерного магнитного резонанса с усилением за счет динамической ядерной поляризации. Магнитный резонанс в жидком состоянии, усиленный динамической ядерной поляризацией (DNP), может помочь ответить на ключевые вопросы: например, как определить скорость ферментативного превращения пары молекул в клетке или in vivo, не прибегая к какому-либо изменению этой пары молекул. Установка в нашей лаборатории оборудования для DNP с растворением и прибытие доктора Риккардо Бальзана, получившего степень PhD в лаборатории Арно Коммента в Лозанне, являются важным шагом вперед для наших исследований.

DNP значительно повышает чувствительность экспериментов, которые мы можем проводить на наших ЯМР-спектрометрах с частотой 500 МГц. Данное оборудование для DNP стало первым из своего рода, установленным во Франции, и я хотел бы отметить, что в его вводе в эксплуатацию принимали участие все члены нашей группы ЯМР; в частности, я хотел бы выделить Жильдаса Берто, нашего инженера-исследователя, и Фатиху Катеб, нашего доцента (maitre de conférences). Основным преимуществом этого метода является возможность прямого количественного определения субстрата и его эндогенных производных в режиме реального времени с временным разрешением в несколько секунд.

Для приготовления поляризующего раствора подготовите 2 мл 1,12 М раствора пирувата натрия с меткой по углероду 13, легированного радикалом TEMPO в концентрации 33 мМ, в смеси дейтерированной воды и дейтерированного этанола в объемном соотношении 2:1 для регистрации сигналов углерода 13. Понизьте температуру криостата динамической ядерной поляризации (ДЯП) с помощью процедуры охлаждения, нажав кнопку cooldown в интерфейсе программного обеспечения криостата. Заполните криостат ДЯП жидким гелием, следуя процедуре заполнения.

Нажмите кнопку заполнения в интерфейсе программного обеспечения криостата. Затем поместите 300 µL оптимизированного поляризационного раствора в контейнер для образца, входящий в комплект с DNP-поляризатором. Заморозьте контейнер с образцом, осторожно погрузив его в баню с жидким азотом.

Удалите жидкий азот, который мог остаться в контейнере с образцом после процедуры замораживания, извлекая контейнер из бани с жидким азотом и переворачивая его вверх дном. Затем поместите образец в криостат, сначала установив контейнер с образцом в держатель. После этого поместите держатель в основной вкладыш криостата, а затем вставьте волновод микроволнового излучателя в держатель образца.

Снизьте температуру криостата, запустив процедуру охлаждения на один Кельвин. Нажмите кнопку охлаждения на один Кельвин в интерфейсе программного обеспечения криостата. Включите источник микроволнового излучения и облучите образец, нажав кнопку включения микроволн в интерфейсе программного обеспечения криостата.

Отсоедините коаксиальный кабель канала детектирования консоли ЯМР от катушки спектрометра, повернув разъем против часовой стрелки на 90 градусов и потянув его. Подключите коаксиальный кабель канала детектирования к коаксиальному разъему криостатной ЯМР-катушки. Затем вставьте штекер кабеля консоли ЯМР в гнездо криостатной ЯМР-катушки, соблюдая положение направляющего штифта.

Плотно прижмите и поверните коннектор по часовой стрелке на 90 градусов. Измерьте тепловой ЯМР-сигнал в твердом состоянии в зоне криостата, используя простую последовательность импульс-прием с некалиброванными импульсами с малым углом поворота, повторяемыми с интервалом t, равным пяти минутам. После настройки измерения введите zg в командной строке программного обеспечения и нажмите клавишу enter на клавиатуре.

После запуска процедуры поляризации измерьте сигнал ЯМР, усиленный DNP, в твердом состоянии, используя ту же процедуру и условия, которые применялись для измерения теплового сигнала. Отсоедините коаксиальный кабель канала детектирования консоли ЯМР от ЯМР-катушки криостата, повернув разъем против часовой стрелки на 90 градусов и потянув его. Затем подключите коаксиальный кабель канала детектирования к коаксиальному разъему катушки спектрометра.

Вставьте штекер кабеля консоли ЯМР в гнездо катушки спектрометра, учитывая положение направляющего штифта. Плотно прижмите и поверните разъем по часовой стрелке на 90 градусов. Свежеприготовьте раствор ЛДГ мышц кролика в концентрации 1 unit/mL в реакционном буфере с добавлением бычьего сывороточного альбумина в концентрации 20 µg/mL.

Затем смешайте 478 µL реакционного буфера, 2 µL раствора LDH и 20 µL дейтерированной воды для стабилизации (запирания) поля спектрометра. Затем перенесите полученный объем раствора 500 µL в 5-мм ЯМР-трубку. Подсоедините переносящую трубку к автоматическому инъектору индивидуальной конструкции, который отделяет гиперполяризованный раствор от гелия, используемого для переноса.

Устройство автоматически вводит 500 µL гиперполяризованного раствора в пробирку с образцом. Перед растворением поместите 5-мм ЯМР-трубку, содержащую 500 µL образца, в изоцентр ЯМР-спектрометра 11.74 T. Влейте 5 mL дейтерированной воды в бойлер вставки для растворения.

Подайте давление и нагрейте дейтерированную воду с помощью резистивной проволоки до достижения температуры примерно 180–200 °C, нажав кнопку prepare heater в интерфейсе программного обеспечения криостата. Нажмите кнопку SS Operations в интерфейсе программного обеспечения криостата. Затем извлеките микроволновод из вставки для растворения.

Опустите вставку для растворения в держатель образца. Вставка для растворения должна достичь дна держателя образца; ее необходимо плотно прижать для создания герметичного соединения с контейнером образца, чтобы предотвратить утечку дейтерированной воды в криостат. Нажмите аппаратный триггер для запуска последовательности растворения — заранее определенной по времени последовательности операций пневматических клапанов.

Сразу после растворения инжектор смешивает 500 µL гиперполяризованного раствора с образцом, помещенным в ЯМР-спектрометр. После растворения измерьте гиперполяризованный ЯМР-сигнал образца в спектрометре с помощью серии последовательностей «импульс — регистрация» с углом отклонения 10 градусов и интервалом между ними 1,5 с, чтобы проследить за динамикой намагниченности субстрата и продукта. После настройки измерения введите zg в командной строке программного обеспечения и нажмите enter.

После полного релаксации намагниченности измерьте тепловой ЯМР-сигнал с помощью серии последовательностей импульс-прием с углом поворота 90 градусов с интервалом около трех минут, что соответствует примерно 3T1. После настройки измерения введите zg в командной строке программного обеспечения и нажмите клавишу enter. Здесь временной ход спектров, полученных с помощью повторных импульсов с углом поворота 10 градусов, демонстрирует чувствительность и временное разрешение данного метода.

После идентификации пиков субстрата пирувата и продукта лактата проводят количественное определение путем интегрирования сигналов метаболитов. Ферментативная активность определяется по временному ходу сигнала продукта с помощью аппроксимации линейной моделью. Для валидации измерения эта же величина оценивается по начальной скорости реакции на основе соотношения сигналов продукта и субстрата.

После освоения метода полное измерение ферментативной активности при правильном выполнении может занять около двух часов. После просмотра этого видео вы должны понять, как получить высокополяризованный субстрат для ЯМР, ввести его в раствор, содержащий фермент, и отслеживать ферментативную активность с помощью ЯМР с усилением за счет ДЯП. При выполнении данной процедуры важно тщательно подготовить ферментативный раствор со свежим ферментом и косубстратами, а также избегать появления пузырьков воздуха в пробирке с образцом.

Благодаря развитию метода динамической ядерной поляризации (DNP) для усиления магнитного резонанса в жидкой фазе, исследователи теперь могут изучать поглощение субстрата и его ферментативную трансформацию внутри различных типов клеток, измеряя скорость образования продукта. Не забывайте, что работа с криогенным оборудованием и сильными магнитными полями может быть крайне опасной. При проведении этих измерений необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты от криогенных жидкостей и проверка отсутствия магнитных объектов.

В отличие от классического ЯМР, ЯМР на основе растворения DNP ограничен экспериментальным временным окном максимум в несколько минут, в зависимости от субстрата и текущего состояния системы. Это препятствует переходу к многомерной спектроскопии. Метод ЯМР с растворением DNP требует дальнейшего развития, чтобы достичь уровня универсальности, присущего классическому многомерному ЯМР.