Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей
2 апреля 2016 г.
К экспериментальной проверке активности энхансера лучше всего подходит анализ потери функции. Здесь представлен эффективный протокол, который использует CRISPR/Cas9-опосредованную делецию для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в клетках F1 ES, которые содержат гибридный геном (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Общая цель данной процедуры заключается в использовании аллель-специфичной делеции с помощью системы CRISPR/Cas9 для изучения регуляции транскрипции генов в эмбриональных стволовых клетках мыши. Основным преимуществом этого метода является использование гибридного генома для создания и анализа моноаллельных делеций. Это устраняет необходимость анализа моноаллельных делеций, которые могут быть нежизнеспособными.
Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области функциональной геномики, например, какой ген регулирует конкретный энхансер и в какой степени активность этого гена зависит от определенного энхансера. Поскольку этот метод позволяет получить представление о плюрипотентности стволовых клеток, его можно применять и к другим системам.
Например, это может помочь нам понять, как стволовые клетки меняют свою судьбу, становясь нейронами, клетками крови или мышцами. После проектирования, конструирования и подтверждения последовательности используемой гидовой РНК (гРНК) подготовьтесь к трансфекции ЭС-клеток плазмидами, не содержащими эндотоксинов. С помощью центрифуги осадите 1×10⁶ эмбриональных стволовых клеток F1, полученных путем скрещивания Mus musculus 129 с Mus castaneus, в пробирке объемом 1,5 мл при 300 ×g в течение пяти минут.
После центрифугирования удалите супернатант и добавьте 100 µL буфера для ресуспендирования, входящего в состав набора. Для делеции целевого участка ДНК добавьте по 5 µg плазмид P Cas9 GFP 5-prime и 3-prime gRNA. Осторожно перемешайте содержимое с помощью пипетки.
Избегайте образования пузырьков. Затем с помощью электронного наконечника пипетки микропоратора аспирируйте 100 µL электропорирующей смеси, стараясь не допустить попадания воздуха в наконечник. После этого установите пипетку в устройство для трансфекции.
Выберите соответствующий протокол и нажмите кнопку запуска. Во время проведения электропорации наблюдайте за наконечником. При правильной настройке из трубчатого электрода должны выходить крошечные пузырьки.
Появление искры указывает на наличие пузырька воздуха, что помешает трансфекции. В этом случае электропорацию необходимо повторить с новой порцией клеток. После электропорации перенесите трансфецированные клетки в чашку диаметром десять сантиметров с желатиновым покрытием, содержащую десять миллилитров среды для ES-клеток.
Инкубируйте трансфецированные клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Через 48 часов с помощью проточного цитометра отсортируйте и изолируйте GFP-положительные ЭСК линии cast nine. Затем высейте от 1 до 1,5 × 10⁴ GFP-положительных клеток в 10-сантиметровую чашку, покрытую желатином и содержащую 10 мл среды для ЭСК.
Посев при такой низкой плотности облегчит отбор отдельных колоний ЭСК. Через четыре-пять дней с помощью микроскопа идентифицируйте отдельные сферические колонии одиночных ЭСК. Используя пипетку, перенесите каждую колонию в отдельную лунку 96-луночного планшета, предварительно обработанного желатином и содержащего 30 µL трипсома.
После того как все колонии будут отобраны и диссоциированы в среду, культивируйте клетки при 37 °C в CO₂-инкубаторе до тех пор, пока большинство лунок не достигнут более 70% конфлюэнтности. Обычно это занимает около двух дней. Когда клетки будут готовы к пассированию, удалите среду и добавьте 30 µL трипсина.
Инкубируйте клетки в течение пяти минут. Затем в каждую лунку добавьте 180 µL среды для ЭСК, чтобы нейтрализовать трипсин. Перемешайте содержимое пипеткой путем всасывания и выпуска жидкости для получения суспензии из одиночных клеток.
Из каждой лунки перенесите 70 µL в каждую из трех 96-луночных планшетов, покрытых желатином, которые содержат по 130 µL среды для ЭС-клеток в каждой лунке. Инкубируйте при 37 °C. Когда клетки на планшетах достигнут конфлюэнтности 70–85%, используйте их для проведения генотипирования и анализа экспрессии каждого клона, как описано в следующих разделах.
Заморозьте стоки клеток, как описано в сопроводительном документе. Далее будут разработаны четыре набора праймеров для скрининга клонов на наличие искомой делеции. В их число входят: внутренние праймеры, внешние праймеры, а также фланкирующие праймеры к gRNA для обоих сайтов мишени gRNA — 5'- и 3'-концевых.
Для начала перейдите на указанный здесь веб-сайт, чтобы получить трек однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), соответствующих генотипам 129 и Cas. Ссылка ведет на веб-страницу лаборатории Митчелла по CRISPR. Там нажмите на указанную ссылку.
Сайт перенаправит вас в браузер геномов UCSC, содержащий дорожку с однонуклеотидными полиморфизмами (snips) между геномами 129 и Cas в сборке генома мыши MM-9. Затем введите координаты области, подлежащей делеции, и нажмите кнопку «go». Увеличьте масштаб региона длиной около 500 bp в центре желаемой делеции, содержащего более трех snips.
Разработка аллель-специфичных праймеров может быть затруднена при малом количестве SNP. Если разработать абсолютно аллель-специфичные праймеры невозможно, можно использовать умеренно аллель-специфичные праймеры. В этом случае при анализе результатов qPCR не забудьте сравнить значения CT для клонов с делецией и без неё.
Теперь нажмите «View» на верхней панели. В выпадающем меню выберите «DNA». Появится страница «Get DNA in Window».
В параметрах форматирования последовательности выберите вариант «все заглавные» (all uppercase), затем нажмите «Get DNA», чтобы отобразить целевую последовательность в верхнем регистре. Скопируйте эту последовательность и вставьте ее в документ Word. Затем сравните последовательность с треком 129 cast snip, выделите позиции снипов и обозначьте 129 снипов строчными буквами.
После завершения работы с последовательностью 129 скопируйте ее для создания двух последовательностей в формате fast day: одной для 129 и одной для Cas. В последовательности Cas замените основание в каждой позиции разреза на соответствующее, обозначив место разреза строчной буквой.
Затем пометьте последовательность соответствующим геномом: 129 или Cas. После этого введите в браузере адрес Primer3Plus. В соответствующее поле вставьте последовательность 129 с заменой фрагмента.
Используйте настройки по умолчанию для разработки праймеров. Чтобы разработать внутренние аллель-специфические праймеры, нажмите на раскрывающееся меню справа от Task и выберите Primer List, затем нажмите Pick Primers. Откроется новая страница со списком прямых и обратных праймеров.
Отметьте флажок, чтобы выбрать прямой или обратный праймер, имеющий однонуклеотидный полиморфизм (SNP), обозначенный строчной буквой либо на 3'-конце, либо в пределах четырех оснований от 3'-конца. Обратите внимание, что праймеры с SNP на 3'-конце демонстрируют повышенную аллельную специфичность при qPCR. Нажмите «Send to Primer3 Manager» в нижней части экрана.
Откроется новая страница с выбранным праймером. Чтобы выбрать второй праймер, вернитесь на страницу со списком праймеров, а затем нажмите кнопку «Назад», чтобы вернуться на главную страницу. В выпадающем меню «Задача» выберите «Детекция».
Главная страница обновится, и в нижней части появятся поля для ввода последовательностей прямого и обратного праймеров. Вставьте последовательность первого праймера в соответствующее поле. Затем перейдите на вкладку General Settings, расположенную рядом с вкладкой Main, и измените диапазон размера продукта на 80–200 base pairs.
Нажмите «Pick Primers». Откроется страница, на которой будут представлены пять возможных пар праймеров для первой последовательности праймера. Выберите набор праймеров из списка пар, отметив флажки слева от праймеров, и нажмите «Send to Primer3 Manager» в нижней части экрана. Это будут внутренние аллель-специфические праймеры 129.
Повторите эти шаги для разработки праймеров к аллелю cast. Затем примените этот метод для разработки внешних аллель-специфичных и неаллель-специфичных праймеров. Наконец, проверьте специфичность праймеров к аллелям с помощью qPCR, как описано в сопроводительном документе.
Выделите геномную ДНК из подготовленного ранее 96-луночного планшета. Кратковременно центрифугируйте планшет, чтобы конденсат осел на дно лунок. Эта ДНК будет использоваться в качестве матрицы для скрининга делеций.
Затем на планшете с 384 лунками проведите qPCR в дубликатах для каждого клона. Используйте двухэтапную ПЦР с последующим анализом кривых плавления и детекцией. После завершения анализа сначала проверьте амплификацию каждого аллеля с помощью внутренних аллель-специфичных праймеров.
Отсутствие амплификации одного аллеля или разница в значениях CT между аллелями более пяти циклов указывает на то, что данные клоны несут гетерозиготную делецию. Отсутствие амплификации обоих аллелей свидетельствует о наличии гомозиготной делеции. Затем проверьте амплификацию каждого аллеля с помощью внешних аллель-специфичных праймеров.
Если целевая делеция превышает 1 KB, амплификация с внешними праймерами произойдет только при наличии делеции. Значение CT от 22 до 28 подтверждает делецию. Для целевых делеций размером менее 1 KB подтвердите размер ампликона с помощью электрофореза.
Скрининг 96-луночного планшета клонов с делециями проводили методом qPCR с использованием аллель-специфических внутренних праймеров. Серые полосы соответствуют продуктам амплификации Cas-специфических праймеров, а черные полосы — 129-специфических праймеров. Низкое значение CT или отсутствие амплификации с внутренними праймерами указывает на делецию мишени.
Затем клоны с делецией в одном или обоих аллелях подвергаются скринингу с использованием внешних праймеров. Амплификация с внешними праймерами подтверждает наличие делеции. Клоны с моноаллельной делецией скринируют с помощью праймеров, фланкирующих целевые области гРНК, чтобы подтвердить отсутствие вставок или делеций (инделей) в неделетированном аллеле.
Для последующего анализа экспрессии используются только моноаллельные клоны без крупных инделей в целевых сайтах на неделетированном аллеле. Здесь представлены репрезентативные результаты для клонов с делецией 129 или Cas SCR. SCR представляет собой недавно описанный специфический энхансер Sox2 в ЭК клетках.
Красные столбцы представляют экспрессию аллеля Sox2 Cas, а синие столбцы — амплификацию аллеля Sox2 129. Как видно из этого рисунка, делеция SCR в аллеле 129 или Cas приводила к снижению экспрессии Sox2 в CIS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как создавать крупные делеции с помощью технологии CRISPR и использовать аллель-специфические праймеры для генотипирования полученных делеционных клонов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол использования делеции, опосредованной системой CRISPR/Cas9, для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в эмбриональных стволовых клетках мыши. Этот метод использует гибридный геном для облегчения анализа моноаллельных делеций, что позволяет получить новые данные о регуляции генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Функциональная геномика
- Регуляция транскрипции генов
- Технология CRISPR/Cas9
Теоретическая база
- Понимание активности энхансеров имеет решающее значение для регуляции экспрессии генов.
- Анализ потери функции является ключевым подходом в этой области.
- Эмбриональные стволовые клетки мыши служат моделью для изучения регуляции генов.
- Гибридные геномы могут помочь в анализе специфических взаимодействий генов.
Цель исследования
- Для исследования роли специфических энхансеров в регуляции экспрессии генов.
- Для определения зависимости генов от конкретных энхансеров.
- Для более глубокого понимания плюрипотентности стволовых клеток и возможностей ее применения.
Используемые методы
- Метод делеции с помощью системы CRISPR/Cas9.
- Использование ЭСК поколения F1 с гибридным геномом (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Анализ моноаллельных делеций для изучения транскрипции генов.
- Экспериментальное подтверждение активности энхансера посредством анализа потери функции.
Основные результаты
- Успешная реализация аллель-специфических делеций в стволовых клетках.
- Представление о регуляции транскрипции генов специфическими энхансерами.
- Демонстрация применимости метода к различным биологическим системам.
- Вклад в понимание функциональной геномики.
Выводы
- Метод CRISPR/Cas9 эффективен для изучения активности энхансеров.
- Данный подход позволяет прояснить взаимосвязь между энхансерами и экспрессией генов.
- Полученные результаты могут иметь более широкое значение для исследований стволовых клеток и функциональной геномики.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной промышленности
Данный протокол позволяет точно исследовать функцию энхансеров посредством аллель-специфичной делеции с помощью системы CRISPR/Cas9 в гибридных эмбриональных стволовых клетках мыши, что решает ключевую проблему валидации мишеней: установление связи между дистальными регуляторными элементами и экспрессией генов. Благодаря использованию естественных SNP между аллелями Mus musculus 129 и Mus castaneus, данный подход позволяет механистически снизить риски при изучении транскрипционных регуляторов, избегая летальности гомозигот, что обеспечивает прогностическую достоверность взаимосвязей «энхансер-ген» на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем тестирования необходимости энхансера для экспрессии генов в физиологически релевантной модели стволовых клеток.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет моноаллельного анализа потери функции, что позволяет избежать влияния фенотипических искажений, возникающих при полном удалении регуляторного элемента.
- Научная ценность: повышает достоверность выбора мишени, предоставляя прямые доказательства цис-регуляции посредством скрининга аллель-специфического делетирования с использованием SNP-дискриминирующих праймеров.
Скрининг и разработка анализа
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа путем генотипирования на основе кПЦР с использованием аллель-специфичных внутренних и внешних праймеров для различения гетерозиготных, гомозиготных клонов и клонов дикого типа.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый рабочий процесс скрининга с использованием подбора колоний из 96-луночных планшетов и проведения кПЦР в 384-луночных планшетах для высокопроизводительного подтверждения делеций.
- Практическая ценность: поддерживает воспроизводимость анализа, требуя подтверждения отсутствия инделей в неделеционном аллеле с помощью праймеров, фланкирующих gRNA, перед анализом экспрессии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает понимание системных механизмов, имеющих значение для патологий, путем изучения регуляции факторов плюрипотентности, таких как Sox2, опосредованной энхансерами в эмбриональных стволовых клетках мыши.
- Трансляционная значимость: повышает точность прогнозирования решений о судьбе стволовых клеток, связывая делецию энхансеров с изменениями в экспрессии генов, значимых для путей дифференцировки.
- Трансляционная значимость: позволяет механистически снизить риски при выборе мишеней в энхансерах с помощью количественного анализа экспрессии (qPCR), демонстрирующего аллель-специфическое снижение транскрипции целевого гена.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от биологических открытий до идентификации мишеней, обеспечивая функциональную валидацию некодирующих регуляторных элементов перед их терапевтическим воздействием, при этом полученные результаты напрямую служат основой для приоритизации мишеней и принятия решений по снижению рисков.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о взаимосвязи энхансеров и генов посредством аллель-специфического делетирования и анализа экспрессии в генетически доступной модели.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного рабочего процесса qPCR с использованием аллель-специфических праймеров для количественной оценки эффективности и специфичности делеции в различных клонах.
- Аналитика: Предоставляет количественные измерения зависимых переменных (значения CT, кривые плавления), которые позволяют сравнивать аллельную экспрессию и зиготность делеции.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем изучения функции энхансеров в модели стволовых клеток, имеющей значение для дифференцировки и моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность повторного использования метода валидации энхансеров в различных геномных регионах с применением того же дизайна праймеров на основе SNP и рабочего процесса CRISPR.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в функции энхансера благодаря прямым доказательствам потери функции без влияния компенсаторных механизмов, возникающих при гомозиготной делеции.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет дизайна аллель-специфичных праймеров на основе SNP и протоколов скрининга методом qPCR.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) за счет уточнения зависимости от энхансера и снижения механистической неопределенности при валидации мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация транскрипционных мишеней с учетом рисков на основе валидированных взаимосвязей «энхансер-ген» в соответствующем контексте заболевания на клеточном уровне.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области дизайна CRISPR/Cas9, разработки аллель-специфичных праймеров и анализа qPCR для аллельной дискриминации.
- Зависимость от наличия доступа к эмбриональным стволовым клеткам гибридов F1 с достаточной плотностью SNP (примерно каждые 125 bp) для надежного аллель-специфичного таргетинга.
- Необходима стандартизация рабочих процессов по дизайну праймеров между исследовательскими группами с использованием браузера геномов UCSC и программы Primer3Plus для обеспечения аллельной специфичности.
- Требуются адаптационные меры для негибридных моделей, в которых плотность SNP может быть недостаточной для аллель-специфичного разрешения.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость подтверждения отсутствия инделей в неделетированном аллеле перед тем, как приписывать изменения экспрессии потере энхансера.
