Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей
2 апреля 2016 г.
К экспериментальной проверке активности энхансера лучше всего подходит анализ потери функции. Здесь представлен эффективный протокол, который использует CRISPR/Cas9-опосредованную делецию для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в клетках F1 ES, которые содержат гибридный геном (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Общая цель этой процедуры заключается в использовании аллель-специфичной делеции CRISPR/Cas9, опосредованной для изучения регуляции транскрипции генов в эмбриональных стволовых клетках мыши. Основное преимущество данной методики, которая использует гибридный геном для генерации и анализа моноаллельных делеций. Вместо этого он устраняет необходимость анализа моноаллельных усиленных делеций, которые могут быть нежизнеспособными.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функциональной геномики. Например, какой ген регулирует тот или иной конкретный энхансер и насколько этот ген зависит от какого-либо одного энхансера в плане своей активности. Поскольку этот метод может дать представление о плюрипотентности стволовых клеток, он также может быть применен к другим системам.
Например, это может помочь нам понять, как стволовые клетки меняют свою судьбу, превращаясь в нейроны, клетки крови или мышцы. После проектирования, конструирования и подтверждения последовательности направляющей РНК, или гРНК, которая будет использоваться, подготовьтесь к трансфекции плазмид, свободных от эндотоксина, в ES-клетки. Используя центрифугу, гранулируйте от одного умноженного на десять до шестой раза эмбриональные стволовые клетки F1, полученные путем скрещивания Mus musculus 129 с Mus castaneus в пробирке объемом 1,5 миллилитра при 300-кратном g' в течение пяти минут.
После отжима выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 100 микролитров буфера для ресуспензии, предоставленного производителем комплекта. Для делеции целевого участка ДНК добавьте по пять микрограммов плазмид P Cas9 GFP 5-prime и 3-prime gRNA. С помощью пипетки аккуратно перемешайте.
Избегайте появления пузырьков. Затем с помощью электронного наконечника дозатора микропоратора отсосите 100 микролитров электропориционной смеси, стараясь не допустить попадания воздуха внутрь наконечника. Затем подключите пипетку к трансфекционному устройству.
Выберите подходящий протокол и нажмите «Пуск». Во время работы электропорации следите за наконечником. При правильной настройке из трубчатого электрода должны выходить крошечные пузырьки.
Искра указывает на наличие пузырька воздуха и будет мешать трансфекции. Если это произошло, электропорацию необходимо повторить с новой партией клеток. После электропорации перенесите трансфицированные клетки в десятисантиметровую чашку, покрытую желатином, содержащую десять миллилитров среды для ES-клеток.
Инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа. Через 48 часов с помощью проточного цитометра отсортируйте и изолируйте слепые девять GFP-положительных ES-клеток. Затем скармливайте от 1 до 1,5 умножить 10 на четвертую GFP-положительную клетку в 10-сантиметровую посуду, покрытую желатином, содержащую 10 миллилитров среды ES-клеток.
Покрытие с такой низкой плотностью облегчит захват отдельных колоний ES-клеток. Через четыре-пять дней с помощью микроскопа определите отдельные колонии одиночных ЭС-клеток шарообразной формы. С помощью пипетки перенесите каждую колонию в одну лунку 96-луночного планшета, предварительно обработанного желатином и содержащего 30 микролитров трипсома.
После того, как все колонии будут отобраны и диссоциированы в среду, выращивайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе углекислого газа до тех пор, пока большинство лунок не соберутся более чем на 70%. Обычно на это уходит около двух дней. Когда клетки будут готовы к расщеплению, удалите среду и добавьте 30 микролитров трипсома.
Инкубируйте клетки в течение пяти минут. Затем в каждую лунку добавляют по 180 микролитров среды ES клеток для нейтрализации трипсома. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы получить суспензию за одну клетку.
Из каждой лунки переложите по 70 микролитров в каждую из трех покрытых желатином 96-луночных планшетов, содержащих 130 микролитров среды ES-клеток в каждой лунке. Инкубировать при температуре 37 градусов по Цельсию. Когда слияние планшетов достигнет 70–85%, используйте их для выполнения генотипирования и анализа экспрессии каждого клона, как описано в следующих разделах.
Заморозьте запасы ячеек, как описано в сопроводительном документе. Здесь будут разработаны четыре набора праймеров для скрининга клонов на предмет желаемого удаления. К ним относятся: внутренние праймеры, внешние праймеры и фланкирующие праймеры гРНК для участков-мишеней 5-прайм и 3-прайм-мишеней гРНК.
Начните с посещения показанного здесь веб-сайта, чтобы получить однонуклеотидный полиморфизм или след снип, соответствующий генотипам 129 и Cas. Это ведет на веб-страницу Mitchell Lab CRISPR. Там нажмите на указанную ссылку.
Сайт будет перенаправлен на браузер генома UCSC, содержащий трек, отображающий фрагменты между геномами 129 и Cas в сборке генома мыши MM-9. Далее введите координаты региона, который нужно удалить. и нажмите на кнопку «Увеличить область примерно в 500 пар оснований в середине желаемого удаления, содержащего более трех фрагментов».
Конструкция аллель-специфичного праймера может быть затруднена, если ножниц мало. Если невозможно разработать абсолютные аллель-специфичные праймеры, можно использовать умеренно аллель-специфичные праймеры. Просто не забудьте сравнить значения CT между удаленными и неудаленными клонами во время анализа результатов количественной ПЦР.
Теперь нажмите на «Вид» на верхней панели. В выпадающем меню выберите ДНК. Появится страница "Получить ДНК в окне".
В параметрах форматирования последовательности выберите все прописные буквы, затем нажмите «Получить ДНК», чтобы отобразить целевую последовательность во всех прописных буквах. Скопируйте эту последовательность и вставьте ее в файл документа Word. Затем сравните последовательность с дорожкой 129 cast snip и выделите позиции snip и отметьте 129 snip строчными буквами.
Когда вы закончите работу с последовательностью 129, скопируйте ее, чтобы создать две последовательности в формате быстрого дня. Один на 129 и один на Кас. В последовательности применения подставляйте правильную основу в каждую позицию ножниц, отмечая ее строчными буквами.
Затем пометьте последовательность соответствующим ей геномом, 129 или Cas. Затем в браузере введите адрес для Primer3Plus. В соответствующую область вставляем подставленный нож 129 последовательности.
Используйте настройки по умолчанию для проектирования грунтов. Чтобы разработать праймеры, специфичные для внутренних аллелей, нажмите на выпадающее меню справа от пункта «Задача» и выберите «Список праймеров», а затем нажмите на «Выбрать праймеры». Откроется новая страница со списком прямых и обратных грунтовок.
Установите флажок выбора, чтобы выбрать прямой или обратный праймер, у которого строчная строчка обозначена либо на конце 3-прайма, либо в пределах четырех оснований от 3-прайм-энда. Обратите внимание, что праймеры, которые имеют срез на 3-прайм-конце, демонстрируют повышенную специфичность аллелей во время количественной ПЦР. Нажмите «Отправить в Primer3 Manager» в нижней части экрана.
Откроется новая страница с выбранным праймером. Чтобы выбрать второй учебник, вернитесь на страницу со списком учебников и нажмите кнопку «Назад», чтобы вернуться на главную страницу. В выпадающем меню задачи выберите Обнаружение.
Главная страница обновится, а внизу появятся левое и правое поля с последовательностью праймеров. Вставьте первую последовательность грунтовок в соответствующую коробку. Далее перейдите на вкладку «Общие настройки», расположенную рядом с вкладкой «Основные», и измените настройку диапазона размеров товара на 80–200 пар оснований.
Нажмите «Выбрать праймеры»Откроется страница, отображающая пять возможных пар праймеров для первой последовательности праймеров. Выберите набор праймеров из списка пар праймеров, установив флажки слева от праймеров и нажав «Отправить в Primer3 Manager» в нижней части экрана. Это будут 129 внутриаллель-специфичных праймеров.
Повторите эти шаги для проектирования грунтовок для литого аллеля. Затем примените этот метод для разработки внешних аллель-специфичных праймеров и неаллель-специфичных праймеров. Наконец, проверьте праймеры на специфичность аллелей с помощью количественной ПЦР, как описано в сопроводительном документе.
Извлеките геномную ДНК из подготовленного ранее 96-луночного планшета. Кратковременно центрифугируйте пластину, чтобы конденсат осел на дно лунки. Эта ДНК будет служить шаблоном для скрининга делеции.
Затем на 384-луночном планшете выполните qPCR и продублируйте его для каждого клона. Используйте двухэтапную ПЦР с последующим анализом кривой расплава с обнаружением. После прогона сначала проверьте каждый аллель на амплификацию с помощью внутренних аллель-специфичных праймеров.
Отсутствие амплификации одного аллеля или разницы значений КТ более чем в пять циклов между аллелями позволяет предположить, что эти клоны несут гетерозиготную делецию. Отсутствие амплификации обоих аллелей позволяет предположить, что они несут гомозиготную делецию. Затем проверьте каждый аллель на амплификацию с помощью внешних аллель-специфичных праймеров.
Если размер целевой делеции превышает один КБ, амплификация внешними праймерами будет выполняться только при наличии делеции. Значение CT от 22 до 28 подтверждает делецию. Для целевых делеций размером менее одного КБ подтвердите размер ампликона с помощью элтрофофореза.
96-луночный планшет с клонами делеции был проверен с помощью количественной ПЦР с использованием аллель-специфичных внутренних праймеров. Серые полосы представляют капсюли, специфичные для Cas, а черные полосы представляют амплификацию из специфичных для Cas грунтов. Низкое значение КТ или отсутствие амплификации внутренними праймерами указывает на делецию мишени.
Клоны с делецией на одном или обоих аллелях затем экранируют с помощью наружных праймеров. При использовании внешних праймеров амплификация подтверждает делецию. Клоны с моноаллельной делецией проверяют с помощью праймеров, фланкирующих целевые области гРНК, чтобы подтвердить отсутствие вставок или делеций, называемых инделами, на неудаленном аллеле.
В последующем анализе экспрессии используются только моноаллельные клоны без больших инделов в целевых сайтах на неудаленном аллеле. Здесь представлены репрезентативные результаты удаления клонов из 129 или Cas SCR. SCR является недавно описанным специфическим для Sox2 энхансером в ES-клетках.
Красные столбцы представляют выражение аллеля Sox2 Cas, а синие столбцы представляют усиление аллеля Sox2 129. Как видно на этом рисунке, делеция SCR по аллелю 129 или Cas снижала экспрессию Sox2 в СНГ. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать большую делецию с помощью технологии CRISPR и использовать аллель-специфичные праймеры для генотипирования удаленных клонов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол использования делеции, опосредованной системой CRISPR/Cas9, для изучения аллель-специфической регуляции транскрипции генов в эмбриональных стволовых клетках мыши. Этот метод использует гибридный геном для облегчения анализа моноаллельных делеций, что позволяет получить новые данные о регуляции генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Функциональная геномика
- Регуляция транскрипции генов
- Технология CRISPR/Cas9
Теоретическая база
- Понимание активности энхансеров имеет решающее значение для регуляции экспрессии генов.
- Анализ потери функции является ключевым подходом в этой области.
- Эмбриональные стволовые клетки мыши служат моделью для изучения регуляции генов.
- Гибридные геномы могут помочь в анализе специфических взаимодействий генов.
Цель исследования
- Для исследования роли специфических энхансеров в регуляции экспрессии генов.
- Для определения зависимости генов от конкретных энхансеров.
- Для более глубокого понимания плюрипотентности стволовых клеток и возможностей ее применения.
Используемые методы
- Метод делеции с помощью системы CRISPR/Cas9.
- Использование ЭСК поколения F1 с гибридным геномом (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Анализ моноаллельных делеций для изучения транскрипции генов.
- Экспериментальное подтверждение активности энхансера посредством анализа потери функции.
Основные результаты
- Успешная реализация аллель-специфических делеций в стволовых клетках.
- Представление о регуляции транскрипции генов специфическими энхансерами.
- Демонстрация применимости метода к различным биологическим системам.
- Вклад в понимание функциональной геномики.
Выводы
- Метод CRISPR/Cas9 эффективен для изучения активности энхансеров.
- Данный подход позволяет прояснить взаимосвязь между энхансерами и экспрессией генов.
- Полученные результаты могут иметь более широкое значение для исследований стволовых клеток и функциональной геномики.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для профильной промышленности
Данный протокол позволяет точно исследовать функцию энхансеров посредством аллель-специфичной делеции с помощью системы CRISPR/Cas9 в гибридных эмбриональных стволовых клетках мыши, что решает ключевую проблему валидации мишеней: установление связи между дистальными регуляторными элементами и экспрессией генов. Благодаря использованию естественных SNP между аллелями Mus musculus 129 и Mus castaneus, данный подход позволяет механистически снизить риски при изучении транскрипционных регуляторов, избегая летальности гомозигот, что обеспечивает прогностическую достоверность взаимосвязей «энхансер-ген» на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем тестирования необходимости энхансера для экспрессии генов в физиологически релевантной модели стволовых клеток.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет моноаллельного анализа потери функции, что позволяет избежать влияния фенотипических искажений, возникающих при полном удалении регуляторного элемента.
- Научная ценность: повышает достоверность выбора мишени, предоставляя прямые доказательства цис-регуляции посредством скрининга аллель-специфического делетирования с использованием SNP-дискриминирующих праймеров.
Скрининг и разработка анализа
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа путем генотипирования на основе кПЦР с использованием аллель-специфичных внутренних и внешних праймеров для различения гетерозиготных, гомозиготных клонов и клонов дикого типа.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый рабочий процесс скрининга с использованием подбора колоний из 96-луночных планшетов и проведения кПЦР в 384-луночных планшетах для высокопроизводительного подтверждения делеций.
- Практическая ценность: поддерживает воспроизводимость анализа, требуя подтверждения отсутствия инделей в неделеционном аллеле с помощью праймеров, фланкирующих gRNA, перед анализом экспрессии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: обеспечивает понимание системных механизмов, имеющих значение для патологий, путем изучения регуляции факторов плюрипотентности, таких как Sox2, опосредованной энхансерами в эмбриональных стволовых клетках мыши.
- Трансляционная значимость: повышает точность прогнозирования решений о судьбе стволовых клеток, связывая делецию энхансеров с изменениями в экспрессии генов, значимых для путей дифференцировки.
- Трансляционная значимость: позволяет механистически снизить риски при выборе мишеней в энхансерах с помощью количественного анализа экспрессии (qPCR), демонстрирующего аллель-специфическое снижение транскрипции целевого гена.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от биологических открытий до идентификации мишеней, обеспечивая функциональную валидацию некодирующих регуляторных элементов перед их терапевтическим воздействием, при этом полученные результаты напрямую служат основой для приоритизации мишеней и принятия решений по снижению рисков.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о взаимосвязи энхансеров и генов посредством аллель-специфического делетирования и анализа экспрессии в генетически доступной модели.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного рабочего процесса qPCR с использованием аллель-специфических праймеров для количественной оценки эффективности и специфичности делеции в различных клонах.
- Аналитика: Предоставляет количественные измерения зависимых переменных (значения CT, кривые плавления), которые позволяют сравнивать аллельную экспрессию и зиготность делеции.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем изучения функции энхансеров в модели стволовых клеток, имеющей значение для дифференцировки и моделирования заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность повторного использования метода валидации энхансеров в различных геномных регионах с применением того же дизайна праймеров на основе SNP и рабочего процесса CRISPR.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в функции энхансера благодаря прямым доказательствам потери функции без влияния компенсаторных механизмов, возникающих при гомозиготной делеции.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет дизайна аллель-специфичных праймеров на основе SNP и протоколов скрининга методом qPCR.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) за счет уточнения зависимости от энхансера и снижения механистической неопределенности при валидации мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация транскрипционных мишеней с учетом рисков на основе валидированных взаимосвязей «энхансер-ген» в соответствующем контексте заболевания на клеточном уровне.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области дизайна CRISPR/Cas9, разработки аллель-специфичных праймеров и анализа qPCR для аллельной дискриминации.
- Зависимость от наличия доступа к эмбриональным стволовым клеткам гибридов F1 с достаточной плотностью SNP (примерно каждые 125 bp) для надежного аллель-специфичного таргетинга.
- Необходима стандартизация рабочих процессов по дизайну праймеров между исследовательскими группами с использованием браузера геномов UCSC и программы Primer3Plus для обеспечения аллельной специфичности.
- Требуются адаптационные меры для негибридных моделей, в которых плотность SNP может быть недостаточной для аллель-специфичного разрешения.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость подтверждения отсутствия инделей в неделетированном аллеле перед тем, как приписывать изменения экспрессии потере энхансера.
