High Yield Экспрессия рекомбинантных белков человека с временной трансфекции клеток НЕК293 в виде суспензии

Общая цель этой процедуры заключается в экспрессии гликопротеинов млекопитающих с соответствующим гликозилированием млекопитающих путем нацеливания рекомбинантных белков на секреторный путь, опосредованный ER и GOGI. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы иммунологии, такие как роль спецификации, закономерности в структуре и потенциале иммунной активации антител и фрагментов антител. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она использует человеческие клетки для экспрессии белков человека, что обеспечивает соответствующему клеточному миссионеру возможность правильно сворачивать и модифицировать целевые белки.

Встряхиватель инкубатора для создания клеток должен работать при 135 об/мин, влажности 80%, углекислом газе 8% и 37 градусах Цельсия не менее чем за час до посевной инокуляции. Включите УФ-лампу шкафа биобезопасности, разогрейте герметичные бутылки со средой А и средой В на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Выключите ультрафиолетовые лампы и простерилизуйте шкаф биобезопасности с помощью 70% раствора этанола и воды.

Простерилизуйте колбу Эрленмейера объемом 125 мл с вентилируемыми крышками, пипетками и бутылками с предварительно подогретым фильтрующим материалом путем распыления 70%-ного этанола в водном растворе. Помещайте эти предметы в шкаф биобезопасности на протяжении всей процедуры. Все предметы должны быть стерилизованы таким образом, прежде чем они будут помещены в бокс биобезопасности.

Приготовьте свежую питательную среду для культуры объемом 30 миллилитров, взяв 26 миллилитров среды А и три миллилитра среды В и переложив в колбу Эрленмейера объемом 125 миллилитров. Перемешайте путем легкого встряхивания, согрев, флакон с HEK 2 93 F ячейками, предварительно замороженными при температуре минус 80 градусов Цельсия на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы частично разморозить ячейки. На это уходит около одной минуты и клетки не должны полностью размораживаться.

Затем простерилизуйте внешнюю часть флакона 70% этанолом в водном растворе и переместите его в шкаф для биобезопасности. С помощью пипетки объемом в один миллилитр извлеките клеточную суспензию и переложите ее в колбу Эрленмейера объемом 125 миллилитров, содержащую 29 миллилитров свежей питательной среды. Закройте крышку колбы с культурой и поместите колбу в шейкер инкубатора на 24 часа.

Через 24 часа после посева культуры. Проверьте плотность клеток, простерилизуйте колбу с 70% раствором этанола и воды и переместите ее в шкаф биобезопасности. С помощью одномиллилитровой пипетки и пипетки медленно извлеките 100 микролитров культуры и перенесите ее в стерильную эйноровую пробирку объемом 0,5 миллилитров

Закройте крышку колбы для культур и как можно скорее верните колбу для культур в шейкер инкубатора. Смешайте 7,5 микролитров раствора трианового синего с 7,5 микролитрами клеток. Энергично перемешайте, а затем переложите 7,5 микролитров смеси на счетное горло.

Включите автоматический счетчик ячеек и поместите счетное стекло в загрузочную камеру. Автоматический считыватель активируется, и ячейки автоматически подсчитываются в единицах количества клеток на миллилитр и процента жизнеспособности. Определяют объем донорской культуры, необходимый для переноса в свежую культуральную среду, чтобы получить клеточную плотность 300 000 живых клеток на миллилитр.

Приготовьте свежую питательную среду, как показано выше, путем переноса 23 миллилитров среды А и трех миллилитров среды В в свежую колбу для культур объемом 125 миллилитров. После этого достаньте из шкафа биобезопасности стоковые флаконы среды А и среды Б, чтобы снизить риск их загрязнения. Достаньте из инкубатора колбу для культивирования клеток HEK 2 93 F.

Распылите на него 70% раствор этанола и воды и поместите в шкаф биобезопасности с помощью новой пипетки. Извлеките правильную аликвоту клеток из культуры и перенесите ее в колбу, содержащую свежую культуру. Терпимая. Перенесите обе культуры из шкафа биобезопасности в шейкер инкубатора.

Вырастите клетки до приблизительной плотности от двух до 3 миллионов живых клеток на миллилитр перед трансфекцией. Проверьте плотность клеток, как показано ранее, и определите количество клеток для трансфекции. С помощью стерильной серологической пипетки.

Переложите соответствующий объем клеточной суспензии в центрифужную пробирку объемом 250 миллилитров. Соберите клетки центрифугированием при 100-кратном G в течение пяти минут. После стерилизации перенесите пробирку с гранулированными клетками в шкаф биобезопасности.

С помощью стерильной пипетки сцедите надосадочную жидкость, состоящую из отработанного. Питательную среду энергично пересылают гранулированным клеткам путем пипетирования вверх и вниз с использованием 10 миллилитров свежей питательной среды и переносят в подготовленную колбу, содержащую свежую трансфекционную культуру. Терпимая. Закрутите крышку на вентилируемой колбе для клеточных культур и инкубируйте колбу в шейкере инкубатора от 15 минут до одного часа, пока клетки инкубируются.

Разбавьте плазменную ДНК и запасы полиэфираминов или ПЭИ с использованием свежей питательной среды до конечной концентрации 0,5 мкг на микролитр. Извлеките колбу с культурой с диспергированными клетками из шейкера инкубатора и отнесите ее в шкаф биобезопасности с помощью микропипетки и 300 мкл плазменной ДНК к культуре и перемешайте путем аккуратного ручного встряхивания при 900 мкл PEI к культуре и снова перемешайте. Затем по 3,8 миллилитра свежей питательной среды.

Перенесите колбу в шейкер инкубатора на 24 часа. Через 24 часа после трансфекции культуру клеток необходимо развести. Для приготовления разбавляющей среды сначала с помощью стерильной серологической пипетки объемом один миллилитр извлечь один миллилитр 220 миллимолярной вальпроевой кислоты или VPA и перенести его в стерильную 50-миллилитровую пробирку.

Затем с помощью стерильной серологической пипетки добавьте в раствор ВПА пять миллилитров предварительно теплой среды В и 44 миллилитра предварительно теплой среды А. В результате получается 50 миллилитров свежей питательной среды с конечной концентрацией 4,4 миллимоляра VPA. Извлеките трансфицированную культуру из инкубатора.

Простерилизуйте внешнюю часть колбы и поместите колбу в шкаф для биологической безопасности. Добавьте к культуре подготовленную среду для разбавления. Перенесите колбу обратно в шейкер инкубатора еще на четыре-пять дней после перевоспитания.

Ежедневно контролируйте жизнеспособность клеток с помощью процедуры, продемонстрированной ранее. Аликвоты также следует сохранять каждый день для анализа экспрессии белка, через пять-шесть дней после трансфекции или если жизнеспособность клеток падает ниже 50%. Соберите надосадочную жидкость, которая будет содержать секретируемый белок в количестве пяти миллилитров 10% раствора отбеливателя, в гранулу клетки HEK и выбросьте как биологически опасный.

Впоследствии белок очищается от собранной надосадочной жидкости. Эта система экспрессии генерировала высокий выход гликозилированных белков, что иллюстрируется этим типичным паттерном экспрессии IgG one fc после транзиторной трансфекции клеток HK 2 93 F. Аффинная очистка с использованием белковой колонки для IgG one FC или никелевой колонки для гистамина, меченного GFP с FC гамма-рецептором 3 А, привела к получению белков с высокой чистотой.

Эта система эффективно экспрессировала изотопно обогащенный IgG one FC в этом двумерном спектре ЯМР, который коррелирует резонансную частоту ядер водорода и непосредственно связанного амидного азота. Было обнаружено 15 атомов хорошо диспергированных сигналов. Различные формы глико получали с помощью клеток HEK 2 93 F и HEK 2 93 s в различных условиях культивирования, как было показано с помощью матричного лазерного масс-спектрометрического анализа ДЕСОРБЦИЯ ИОНИЗАЦИИ.

IgG один FC, экспрессируемый из HEK 2 93 s клеток, укрытых и гликанов, которые имели форму с пятью ано, плюс два остатка N-ацетилглюкозамина, которые не содержали глюкозных гликанов FU из экспресс-материала HEK 2 93 F, представляли собой сложные двухмаршрутные формы с ядром глюкозы FU и в основном с концевым N-ацетилглюкозамином или небольшой долей моно- или дилатационных форм. Добавление ингибитора гликанирования к экспрессии, проведенной с использованием клеток HEK 2 93 F, показало более чем 90%-ное снижение инкорпорации fuco. После освоения создание транзиторной трансфекции может быть завершено за 1,5 часа в первый день и 15 минут во второй день. После периода сцеживания от четырех до шести дней раствор, содержащий белок, может быть собран за 15 минут.

Наконец, очистка белка займет около 1,5 часов, при этом важно помнить о поддержании стабильной культуры перед трансфекцией трансфекции активно растущих клеток и добавлении ДНК перед добавлением PEI. Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как функциональная характеристика белка с использованием ряда биофизических методов, могут быть выполнены для того, чтобы исследовать структуру и функцию экспрессируемого гликопротеина после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению взаимосвязи структурной активности IgG и гликозилирования in vitro и in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить и очищать гликопротеины с помощью нашей комбинации клеток K 2 93 F и вектора PZ N two.