Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать новые гены-кандидаты на пороки развития головного мозга и напрямую подтвердить их причинную роль in vivo. Эта стратегия может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, обнаружив молекулярные пути, связанные с развитием мозга и коррелированными патологиями. Основное преимущество этой стратегии заключается в том, что она поможет обнаружить новые гены, связанные с нарушениями мозга, и разработать новые диагностические инструменты.

Используя этот подход, мы смогли раскрыть решающий вклад гена C6orf70 в патогенез перивентрикулярной узловой гетеротопии, порока развития головного мозга, вызванного аномальной миграцией нейронов. Демонстрировать процедуру будет Фабьен Шаллер, инженер из нашей лаборатории. Подготовьте беременную крысу E15 к процедуре в соответствии с письменным протоколом и в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями.

Убедитесь, что животное должным образом обезболито, что на глаза нанесена офтальмологическая мазь, а брюшная полость должным образом выбрита и продезинфицирована. С помощью острых ножниц сделать двухсантиметровый вертикальный разрез на коже и мышце хвостовой линии живота по средней линии аккуратно обнажить один маточный рог из брюшной полости. Нанесите предварительно подогретый обычный физиологический раствор с температурой 37 градусов Цельсия по каплям для увлажнения эмбрионов.

Поддерживайте влажность матки на протяжении всей процедуры. Чтобы ввести ДНК, аккуратно держите эмбрион в одной руке так, чтобы голова была легко доступна. Затем другой рукой осторожно ввести стеклянный капилляр, соединенный с микроинъектором, в левый боковой желудочек, который находится в одном миллиметре от средней линии и на глубине двух-трех миллиметров.

Используйте микроинъектор для введения примерно одного микролитра ДНК с быстрым зеленым цветом, чтобы обеспечить визуальный мониторинг инъекции. Чтобы электропорировать ДНК в клетках, сначала капните обычный физиологический раствор на поверхность электрода размером три на семь миллиметров. Затем поместите положительный электрод на инъецируемую сторону, а отрицательный электрод на неинъецированный правый желудочек.

Используйте педаль с ножным управлением для подачи пяти электрических импульсов с интервалом 950 миллисекунд. После электропорации верните маточный рог в брюшную полость и добавьте стерильный физиологический раствор, чтобы эмбрионы располагались более естественно и учитывали потерю интраоперационной жидкости. Закройте мышечную стенку рассасывающимися хирургическими швами, затем кожу с помощью простого прерывистого шва.

Обеспечьте послеоперационное обезболивание в течение 48 часов или в соответствии с рекомендациями учреждения. Верните крысу в чистую домашнюю клетку и наблюдайте за ней, пока она не выйдет из наркоза. После фиксации мозга в 4% параформальдегиде, как указано в письменной части протокола, промыть в PBS в течение 10 минут.

Во время промывания приготовьте 50 миллилитров 4%-го агара в PBS, следя за тем, чтобы температура растворенной агарозы не превышала 50 градусов по Цельсию. Разлейте агарозу по пластиковым формочкам для закладки, а затем поместите в агарозу мозги. Поместите встроенные мозги при температуре четыре градуса Цельсия и дайте агарозе полимеризоваться не менее часа.

После того как агароза полимеризуется, обрежьте излишки агарозы вокруг головного мозга, затем приклейте головной мозг к вибратомной опорной плите таким образом, чтобы передний задний доступ к мозгу был перпендикулярен лезвию. Подождав несколько минут, пока клей высохнет, поместите пластину с приклеенным мозгом в вибратомную камеру. Заполните вибратом PBS и начните нарезать секции толщиной 100 микрон.

После среза перенесите срезы на предметные стекла микроскопа и удалите лишнюю жидкость. Затем добавьте несколько капель монтажного средства и наденьте крышку на секции. Дайте высохнуть в течение ночи.

Визуализируйте срезы с помощью 10-кратного увеличения на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Чтобы проанализировать изображения, сначала преобразуйте изображение в 8-битное с помощью соответствующего программного обеспечения для количественного анализа изображений. Затем выберите одну репрезентативную флуоресцентную ячейку GFP и вручную определите ее форму, нажав на оценку и с помощью инструмента свободного выбора рукой нарисовать границу ячейки.

Программное обеспечение автоматически сохраняет диаметр и порог интенсивности ячейки. Нажмите на кнопку «Найти клетки», чтобы позволить программному обеспечению локализовать трансфицированные клетки по всей коре головного мозга. Затем, при необходимости, вручную удалите ложные срабатывания.

Разделите всю толщину коры головного мозга на восемь областей интереса, нормализованных по отдельным участкам, щелкнув по инструменту «Область», выбрав восемь полос области, где полосы 1 и 8 соответствуют зоне желудочка и вершине корковой пластинки соответственно. Затем нажмите «Применить», чтобы позволить программному обеспечению подсчитать взаимное положение клеток, трансфицированных GFP, во всей коре головного мозга. Наконец, нажмите «Сохранить количественную оценку», чтобы экспортировать данные в файл Excel для анализа.

Матричный CGH и полноэкзомное секвенирование идентифицировали C6orf70 как ген-кандидат для аномалий генов развития. Количественная ПЦР определила, что этот ген наряду с PHF10 и DLL1 экспрессируются в коре головного мозга крыс. На следующих изображениях показаны репрезентативные неокортикальные корональные срезы мозга крыс E20 через 5 дней после электропорации либо только зеленой флуоресцентной белковой конструкцией, либо в сочетании с шРНК, нацеленной на кодирующую последовательность C6orf70, или с относительно неэффективной конструкцией несоответствия.

Нокдаун нити А использовался для контроля нарушенной миграции нейронов. Внутриутробная электропорация с использованием шРНК, нацеленной на C6orf70 или филамент А, индуцировала остановку GFP-положительных клеток в желудочковой зоне, как показано белыми стрелками, в то время как клетки, экспрессирующие GFP отдельно или в сочетании с конструкцией несоответствия, не изменяли миграцию нейронов. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь в виду, на каком этапе коркового генезиса вы хотите анализировать: пролиферацию, миграцию или созревание нейронов.

Не стоит забывать, что обучение проведению внутриутробной электропорации в эмбриональном мозге грызуна требует длительного периода обучения, навыков и регулярной практики.