Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении новых генов-кандидатов, связанных с нарушениями развития головного мозга, и в прямой проверке их причинной роли in-vivo. Эта стратегия может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии путем обнаружения молекулярных путей, связанных с развитием мозга и соответствующими патологиями. Основным преимуществом данного подхода является содействие в поиске новых генов, ассоциированных с заболеваниями головного мозга, и разработке новых диагностических инструментов.

С помощью этого подхода нам удалось выявить определяющий вклад гена C6orf70 в патогенез перивентрикулярной узловатой гетеротопии — порока развития мозга, вызванного аномальной миграцией нейронов. Демонстрировать процедуру будет Фабьен Шальер, инженер нашей лаборатории. Подготовьте беременную крысу на 15-й день эмбрионального развития (E15) для проведения процедуры согласно письменному протоколу, а также институциональным и национальным рекомендациям.

Убедитесь, что животное надлежащим образом анестезировано, в глаза наложена офтальмологическая мазь, а живот правильно выбрит и продезинфицирован. С помощью острых ножниц сделайте вертикальный разрез длиной 2 см в коже и мышцах по средней линии каудального отдела живота, после чего осторожно извлеките один рог матки из брюшной полости. Покапельно вводите предварительно нагретый до 37 °C физиологический раствор для увлажнения эмбрионов.

Поддерживайте матку во влажном состоянии на протяжении всей процедуры. Для инъекции ДНК аккуратно удерживайте эмбрион одной рукой так, чтобы голова была легко доступна. Затем другой рукой осторожно введите стеклянный капилляр, подключенный к микроинжектору, в левый боковой желудочек, который расположен в одном миллиметре от средней линии и на глубине двух-трех миллиметров.

Используйте микроинъектор для введения примерно 1 µL ДНК с fast green для визуального контроля инъекции. Чтобы провести электропорацию ДНК в клетки, сначала нанесите физиологический раствор на поверхность электрода размером 3×7 мм. Затем поместите положительный электрод на сторону, где была произведена инъекция, а отрицательный электрод — на неинъецированный правый желудочек.

Используйте ножную педаль для подачи пяти электрических импульсов с интервалом 950 мс. После электропорации верните рог матки в брюшную полость и добавьте стерильный физиологический раствор, чтобы эмбрионы могли занять более естественное положение и для компенсации кровопотери во время операции. Зашейте мышечную стенку рассасывающимися хирургическими нитями, затем кожу простым прерывистым швом.

Обеспечьте послеоперационную анальгезию в течение 48 часов или в соответствии с правилами вашего учреждения. Поместите крысу обратно в чистую домашнюю клетку и наблюдайте за ней до полного выхода из наркоза. После фиксации мозга в 4%параформальдегиде, как описано в текстовой части протокола, промойте его в PBS в течение 10 минут.

Во время промывки подготовьте 50 мл 4% агарозы в PBS, следя за тем, чтобы температура растворенной агарозы не превышала 50 °C. Разлейте агарозу в пластиковые формы для заливки, после чего поместите в агарозу мозг. Поместите образцы мозга в среду при температуре 4 °C и оставьте агарозу для полимеризации минимум на один час.

После полимеризации агарозы обрежьте излишки агарозы вокруг мозга, затем приклейте мозг к базовой пластине вибратома так, чтобы передне-задняя ось мозга была перпендикулярна лезвию. Подождите несколько минут до полного высыхания клея, после чего поместите пластину с приклеенным мозгом в камеру вибратома. Заполните вибратом PBS и начните нарезать срезы толщиной 100 мкм.

После изготовления срезов перенесите их на предметные стекла и удалите излишки жидкости. Затем добавьте несколько капель среды для заключения и накройте срезы покровным стеклом. Оставьте до полного высыхания на ночь.

Выполните визуализацию срезов с 10-кратным увеличением на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Для анализа изображений сначала преобразуйте изображение в 8-битный формат с помощью соответствующего программного обеспечения для количественного анализа изображений. Затем выберите одну репрезентативную GFP-положительную флуоресцентную клетку и вручную определите ее форму, нажав на «estimate» и используя инструмент свободного выделения для отрисовки границы клетки.

Программное обеспечение автоматически сохраняет значения диаметра и порога интенсивности клетки. Нажмите «find cells», чтобы программа локализовала трансфицированные клетки по всей коре. Затем, при необходимости, вручную удалите ложноположительные результаты.

Разделите всю толщину коры на восемь областей интереса, нормализованных в отдельных срезах: для этого нажмите на инструмент выбора области (region tool) и выберите восемь региональных полос, где первая и восьмая полосы соответствуют вентрикулярной зоне и верхней части корковой пластинки соответственно. Затем нажмите «apply», чтобы программа подсчитала относительное положение GFP-трансфицированных клеток во всей коре. Наконец, нажмите «save quantification», чтобы экспортировать данные в файл Excel для последующего анализа.

С помощью сравнительной геномной гибридизации (Array CGH) и полноэкзомного секвенирования был определен C6orf70 как ген-кандидат, связанный с нарушениями развития. Количественная ПЦР показала, что данный ген, наряду с PHF10 и DLL1, экспрессируется в коре головного мозга крысы. На следующих изображениях представлены репрезентативные корональные срезы неокортекса мозга крыс на стадии E20 через 5 дней после электропорации либо только конструктом с зеленым флуоресцентным белком, либо в сочетании с shRNA, нацеленной на кодирующую последовательность C6orf70, либо с относительно неэффективным несоответствующим (mismatch) конструктом.

Нокдаун Filament A использовался в качестве контроля нарушения нейрональной миграции. Электропорация in utero с использованием shRNA, нацеленной на C6orf70 или Filament A, вызывала остановку GFP-положительных клеток в вентрикулярной зоне, на что указывают белые стрелки, в то время как экспрессия только GFP или GFP в сочетании с некомплементарной конструкцией не изменяла нейрональную миграцию. При выполнении этой процедуры важно учитывать, какую стадию кортикального нейрогенеза необходимо проанализировать: пролиферацию, миграцию или созревание нейронов.

Не забывайте, что обучение методу электропорации in utero в эмбриональный мозг грызунов требует длительного периода подготовки, специальных навыков и регулярной практики.