Количественная оценка церебральной сосудистой архитектуры с использованием двухфотонного микроскопии в мышиной модели ВИЧ-индуцированной нейровоспаление

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке изменений в корковых капиллярных сетях после длительного воздействия виротоксина ВИЧ. Этот метод может помочь изучить ключевые изменения в морфологии корковых капилляров, которые могут способствовать патогенезу нейрокогнитивных расстройств, ассоциированных с ВИЧ. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить физиологически точную количественную оценку множественных морфологических параметров капилляров.

Тем не менее, этот метод может дать представление о патогенезе ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств. Его также можно применять при других заболеваниях, при которых происходят сосудистые изменения, таких как болезнь Альцгеймера. Начните эту процедуру с нанесения искусственного слезного геля на глаза мыши, находящейся под наркозом.

Далее побрейте ему голову с помощью электрической бритвы. Затем нанесите раствор повидон-йода для стерилизации кожи головы и дайте ему высохнуть. Под световым микроскопом снимите с животного скальп, чтобы полностью обнажить теменные кости, каудальные лобные кости и точку брегмы.

Нанесите небольшое количество десятипроцентного раствора хлорида железа на череп, чтобы высушить мембрану и легко снять. Впоследствии удалите засохшую мембрану, аккуратно соскоблив череп щипцами. Затем нанесите тонкий слой клея вокруг окна верхней пластины.

Аккуратно прижмите пластину к черепу мыши, чтобы интересующая область оставалась в центре окна. После этого нанесите каплю стоматологического цемента на пластину головки, чтобы полимеризовать клей. Затем нанесите тонкий слой клея по краю окна верхней пластины, чтобы создать резервуар для удержания физиологического раствора.

Как только клей высохнет, вкрутите пластину головки в жгут проводов пластины головки мыши. Удалите клей с окна пластины головки с помощью сверла, прикрепленного к сверлу micro-torp, установленного на 6 000 оборотов в минуту. Останавливайтесь каждые 10–15 секунд, чтобы предотвратить перегрев черепной коробки мыши.

После этого, используя новое сверло, начните утончать череп с помощью набора микроторповых сверл со скоростью 4 000 оборотов в минуту. Осторожно переместите сверло по черепу, не оказывая прямого давления вниз. Как только череп полностью истончится, отсоедините мышь от держателя и положите ее на спину.

обеими задними конечностями, чтобы четко обнажить медиальные бедра. Затем удалите волосы на обоих медиальных бедрах и продезинфицируйте место операции, покрыв бедра повидон-йодом. Далее аккуратно удалите кожу на медиальной правой бедре, над бедренной веной и артерией.

Нанесите примерно три-пять капель 0,9% физиологического раствора на операционное место. Затем отделите бедренную вену от артерии, тупым путем рассекая бедренный сосудисто-нервный пучок. Теперь поместите два трехсантиметровых куска хирургического шва под бедренной артерией, примерно на расстоянии одного сантиметра друг от друга.

Закрутите верхний шов по часовой стрелке, чтобы создать сосудистый жгут, который поможет предотвратить чрезмерную кровопотерю во время катетеризации. Впоследствии с помощью пружинных ножниц сделайте небольшой разрез в бедренной артерии, куда в дальнейшем будет вставлен катетер для контроля физиологических параметров мыши. При этой процедуре удалите кожу на медиальном левом бедре мыши.

Далее найдите бедренную вену. С помощью одномиллилитрового шприца и иглы 30 калибра наберите 130 микролитров раствора флуоресцентного красителя. Медленно введите 100 микролитров красителя в бедренную вену.

После извлечения иглы надавите на место инъекции, чтобы остановить кровотечение и дать красителю циркулировать в течение пяти минут. Затем закройте место операции швами. Осторожно переверните мышь на живот и поместите ее в жгут для головной панели мыши.

Для двухфотонной визуализации in vivo переместите хирургический аппарат к двухфотонному микроскопу и убедитесь, что уровень анестезии животного поддерживается. Затем поместите небольшое количество 0,9% физиологического раствора в резервуар для головной пластины и опустите объектив микроскопа так, чтобы он соприкасался с физиологическим раствором. Затем найдите интересующую вас область с помощью объектива для просмотра яркого поля.

После этого начните двухфотонную визуализацию. Найдите капиллярное русло на экране и увеличьте эту область с помощью оптического зума. Получение изображений капилляров с помощью программного обеспечения для двухфотонной визуализации.

Для двухфотонной визуализации ex vivo сделайте разрез на коже головы от межтеменных костей до лобных костей обезглавленной мыши. Закрепите кожу по бокам черепа указательным и большим пальцами, поместите очень тонкие ножницы под медиальную межтеменную кость и разрежьте череп вдоль сагиттального шва примерно до трех миллиметров после точки брегмы. Затем отделите череп от мозга и осторожно удалите все мозговые оболочки с поверхности мозга с помощью щипцов.

Осторожно проведите щипцами под мозг, чтобы освободить его от черепа. После этого поместите мозг в мозговую матрицу, специфичную для мышей, и промойте ее каплями ACSF. Далее удаляют корональный участок мозга толщиной в миллиметр.

Поместите участок мозга на вогнутое стеклянное стекло, содержащее ACSF, так, чтобы самая передняя часть участка была обращена вверх. Затем аккуратно накройте срез мозга стеклянной крышкой листом. Перенесите предметное стекло на предметный столик микроскопа и нанесите небольшое количество 0,9% физиологического раствора на защитное стекло.

Опустите объектив микроскопа до тех пор, пока он не соприкоснется с физиологическим раствором. Затем определите местоположение средней линии мозга с помощью объектива яркого поля. Теперь начните двухфотонную визуализацию и снова найдите среднюю линию с помощью объектива 25x.

Для этого необходимо найти продольную трещину на корковой поверхности коронального отдела. Затем поместите правый край экрана изображения на среднюю линию и переместите экран зрителя в сторону на три полных кадра. Определите глубину, на которой капилляры едва заметны на экране обзора.

Затем опустите плоскость фокусировки еще на 20 микрометров, чтобы определить верхнюю часть z-стека. Установите толщину изображения равной одному микрометру. Опустите экран обзора на 100 микрометров и отрегулируйте мощность лазера таким образом, чтобы менее одного процента пикселей были перенасыщены.

Наконец, приобретите z-стек. На этом рисунке, после того как срез мозга был подготовлен, расположена область визуализации примерно в 1,5 миллиметрах от средней линии. 100-микрометровый z-стек создает трехмерное изображение, используемое для анализа в аналитическом программном обеспечении Amira.

Затем капиллярная сеть вручную трассируется путем размещения узлов в начале и конце капилляра или в любом месте, где один капилляр разветвляется на другой. В результате получается полностью скелетированное изображение, из которого автоматически извлекаются морфологические параметры. Количество капиллярных узлов, сегментов, средняя длина сегмента и общая длина сегмента могут быть извлечены с помощью двухфотонной визуализации ex vivo срезов мозга мыши.

В этом случае двумерное изображение капиллярных сетей создается с помощью визуализации in vivo, в которой диаметр капилляра может быть извлечен, а общий объем капилляра может быть рассчитан с использованием диаметра капилляра и общей длины сегмента, полученных с помощью визуализации ex vivo. После освоения эта процедура может быть завершена за три с половиной часа, если она выполнена правильно. При выполнении этой процедуры важно действовать быстро, сохраняя при этом стабильный уровень анестезии, поскольку изофлуран может вызвать расширение сосудов кортикальных капилляров, тем самым искажая данные.

Во время этой процедуры можно получить другие параметры капилляров, такие как скорость эритроцитов или поток эритроцитов, что может обеспечить более глубокое понимание патогенных изменений, наблюдаемых при нейрокогнитивных расстройствах, связанных с ВИЧ, и других нейродегенеративных заболеваниях. Удачи в ваших экспериментах.