Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики

Общая цель этого эксперимента заключается в исследовании функциональных и синаптических свойств нейронных проекций и микросхем с использованием оптогенетики ex-vivo. Это включает в себя экспрессию канала родопсина и его активацию в определенных проекциях в сочетании с патч-зажимной записью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о синаптических свойствах локальных и дальних связей внутри и между областями мозга.

Это проиллюстрировано здесь при исследовании нейронных цепей, поддерживающих поведение страха. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изучать схемы и синапсы, которые не поддаются обычным методам электростимуляции. Как правило, людям, плохо знакомым с этим методом, придется преодолеть проблему оптимального выполнения всех необходимых шагов.

Это включает в себя стереотаксическое нацеливание на вирусные инъекции, определение оптимального времени экспрессии канала родпсина, приготовление срезов мозга хорошего качества, а также стабильную активацию и запись света. Перед началом этой части процедуры рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор, сконструированный для экспрессии канала родопсина, слитого с флуоресцентным белком, был введен в медиальную префронтальную кору с помощью стереотаксической хирургии. Подготовьте вибратом, установив сапфировое лезвие и установив его на резку толщиной 320 микрон.

После жертвоприношения в соответствии с утвержденными методами и удаления мозга с помощью скальпеля отрежьте мозжечок, затем изолируйте переднюю часть мозга, содержащую медиальную префронтальную кору. Поместите переднюю часть мозга в ледяной раствор для резки до нарезки. Заполните режущую камеру раствором для холодной резки, поддерживаемым при температуре 4 градуса Цельсия с помощью охлаждающего устройства.

Насытьте раствор кислородом. Промокните мозг насухо фильтровальной бумагой. Приклейте четырехпроцентный агаровый блок, который был разрезан под углом 35 градусов, к вибратомной стадии и приклейте заднюю часть мозговой ткани к этому блоку.

Приклейте два дополнительных блока агара спереди и позади мозгового блока для устойчивости во время нарезки. Поместите столик с прикрепленной тканью в режущую камеру и убедитесь, что он погружен в воду. Начните нарезать острые ломтики.

Разрежьте каждый ломтик пополам и переложите в интерфейсную камеру, снабженную кислородом ACSF комнатной температуры. После разрезания острых срезов миндалевидного тела поместите камеру на водяную баню при температуре 36 градусов Цельсия и дайте срезам восстановиться в течение 35-45 минут. Зафиксируйте подмножество срезов, содержащих место инъекции, для последующего анализа, поместив их между двумя листами фильтровальной бумаги и погрузив их в четырехпроцентный параформальдегид в PBS на ночь.

В данной работе рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор, сконструированный для экспрессии канала родопсина, слитого с флуоресцентным белком, был введен в медиальный отдел медиального коленчатого ядра и прилегающего заднего интраламинарного ядра с помощью стереотаксической хирургии. После получения мозга с помощью скальпеля удалите мозжечок и переднюю часть мозга, а затем охладите среднюю часть мозга в ледяном режущем растворе, как и раньше. Промокните мозг фильтровальной бумагой, а затем приклейте его к вибратомной стадии.

Опять же, закрепите дополнительный блок агара за мозгом для устойчивости во время нарезки. После установки предметного столика в режущую камеру, заполненную четырехградусным раствором для резки, разрежьте корональные срезы размером 320 микрон через миндалевидное тело, разрежьте их пополам и соберите срезы в интерфейсной камере, как и раньше. Под стереомикроскопом с помощью флуоресцентного освещения проверяют место инъекции.

Чтобы подготовить патч-микроскоп к оптогенетической активации волокон и клеток, центрируйте установленный светодиод или светодиод на пути доставки света. Используйте измеритель мощности для измерения интенсивности светодиодного света в задней фокальной плоскости и на выходе каждого объектива на длине волны 470 нанометров. Используйте электронную таблицу для расчета интенсивности света в милливаттах на квадратный миллиметр и создания калибровочной кривой для каждого объектива.

Затем извлеките острый срез миндалевидного тела из интерфейсной камеры и поместите его в камеру для среза, установленную на микроскопе. Расположите срез таким образом, чтобы поверхность среза, обращенная вверх в камере интерфейса, также была направлена вверх в камере записи. Перфузируйте ломтик свежим, насыщенным кислородом ACSF со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту.

Температура должна быть примерно 31 градус по Цельсию. Включите люминесцентную лампу и выберите подходящий набор фильтров для конкретного экспрессируемого флуоресцентного белка. Используйте цель 5x для получения обзора.

И 60-кратная цель для оценки плотности волокна в целевой области. Затем откройте или ограничьте апертуру в световом тракте микроскопа, если это необходимо для проведения эксперимента. Чтобы получить патч-запись, заполните патч-пипетку внутренним раствором и установите ее в держатель электродов.

Надавите на патч-пипетку и медленно опустите ее в раствор для ванны. Затем под визуальным контролем с помощью микроманипулятора опустите пластырь пипетта в срез. Подойдите к интересующему нейрону с помощью патч-пипетки сбоку и сверху.

Сбросьте положительное давление, когда пипетка достигнет поверхности ячейки, как указано ямкой, видимой на поверхности ячейки. Приложите отрицательное давление, чтобы получить гигаseal. Примените дополнительную аспирацию, чтобы разорвать мембранный пластырь и получить запись всей клетки.

Затем стимулируйте помеченные волокна с помощью подключенного светодиода, активируя канал родопсина светом с длиной волны 470 нанометров, одновременно записывая электрические ответы клетки. Для синаптической стимуляции используйте цифровые выходы программного обеспечения для сбора данных, чтобы запустить светодиод. Отрегулируйте интенсивность светодиодной стимуляции вручную.

Повторите стимуляцию с открытой или ограниченной апертурой, если это необходимо для следующей зарегистрированной ячейки или в присутствии определенных исследуемых веществ. После записи зафиксируйте срезы для последующего анализа, поместив их между двумя фильтровальными бумагами и погрузив в четырехпроцентный параформальдегид на ночь. Волокна медиальной префронтальной коры стимулировались с помощью оптогенетической парной импульсной стимуляции, в то время как возбуждающие постсинаптические токи регистрировались от базолатерального основного нейрона миндалевидного тела и интернейрона.

Эти репрезентативные следы показывают парное облегчение пульса и парное угнетение пульса, вызванные стимуляцией. Следующие два изображения демонстрируют ингибирование прямой связи, вызванное оптогенетической активацией волокон медиальной префронтальной коры. На этом первом изображении показан репрезентативный возбуждающий постсинаптический ток при 70 милливольтах и тормозящий постсинаптический ток при нуле милливольт в базолатеральном главном нейроне миндалевидного тела.

Тормозной постсинаптический ток имеет более длительную синаптическую латентность по сравнению с возбуждающим постсинаптическим током, указывающим на дисинаптический и моносинаптический вход соответственно. На этом изображении показано, что свет, вызванный фазовой возбуждающей и тормозной последовательностью постсинаптического тока при напряжении 50 мВ, блокируется антагонистом каината AMPA, CNQX, что еще больше подтверждает дисинаптическую природу тормозящего постсинаптического тока. На этом изображении показаны эффекты последующего блокирования возбуждающей и тормозной последовательности постсинаптического тока при напряжении 50 мВ блокатором хлоридных каналов, пикротоксином и пикротоксином плюс CNQX.

Тормозной постсинаптический ток блокируется пикротоксином, а оставшийся возбуждающий постсинаптический ток — CNQX. После освоения подготовка срезов мозга и запись вызванных светом реакций может быть выполнена в течение от нескольких часов до целого дня. Предпосылками являются хорошие места инъекций и достаточная экспрессия канала родопсина в клетках и проекциях, подлежащих изучению.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анатомические исследования меченых аксонов и синапсов на световом и электронно-микроскопическом уровне. Это позволяет соотнести функциональные с анатомическими и молекулярными свойствами активированных синапсов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать все необходимые шаги для анализа светоактивируемых волокон и срезов мозга.

Это включает в себя экспрессию родопсина в канале, оценку и активацию меченых волокон, а также запись и анализ синаптических реакций.