Индукция материнской иммунной активации у мышей в середине беременности Стадии с вирусными Mimic Poly (I: C)

Общая цель данной процедуры заключается в индукции материнской иммунной активации (MIA) у мышей путем внутрибрюшинного введения вирусного миметика poly на средней стадии эмбрионального развития. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейроиммунологии, например, о том, как иммунная дисфункция может приводить к нарушениям развития мозга и поведения. Основным преимуществом данной методики является то, что она специально разработана для исследователей, изучающих MIA как фактор риска окружающей среды при возникновении аутизма и шизофрении.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как незначительные различия в методе индукции MIA могут существенно изменить последующую реакцию у потомства. Чтобы организовать спаривание с фиксированным временем, начните с размещения по пять самок мышей в стандартных клетках, расположенных рядом друг с другом, для синхронизации их эстральных циклов; каждое животное следует пометить с помощью прокола ушной раковины. За два-ноль часов до начала темного цикла распределите самок по две особи в клетку, взвесьте и запишите массу тела каждой мыши, после чего добавьте по одному самцу в каждую клетку с двумя самками.

В интервале от 0 до 4 часов после окончания темного цикла аккуратно приподнимите каждую самку мыши за основание хвоста, позволяя животному ухватиться передними лапами за решетку клетки, чтобы определить наличие беловатой массы в вагинальном отверстии. Если пробка не видна, осторожно введите наконечник пипетки объемом 200 µL в вагинальное отверстие. Сопротивление при введении, вызванное коагуляцией, подтверждает образование пробки.

Поместите мышей с вагинальными пробками в новую клетку, так как наличие пробки подтверждает только факт спаривания. На 10,5–11,5 эмбриональные дни возьмите каждую самку с пробкой за основание хвоста и проверьте наличие выпячивания в области живота, затем взвесьте мышей для подтверждения беременности и пересадите беременных животных в индивидуальные чистые клетки. Отвесьте порошок poly(I:C) в конической пробирке объемом 50 milliliter.

На 12,5 эмбриональный день добавьте соответствующий объем 0,9% раствора хлорида натрия к соответствующему объему poly(I:C) в коническую пробирку и закройте крышку. Осторожно перекатывайте каплю физраствора по порошку до полного растворения и получения прозрачного раствора. Затем центрифугируйте пробирку и перенесите раствор poly(I:C) в микроцентрифужную пробирку.

Используйте спектрофотометр для измерения соотношения поглощения при 260 и 280 нм раствора poly(I:C). Согласно описанию производителя, это соотношение должно составлять от 1.54 до 1.82. Затем взвесьте первую мышь и наберите в инсулиновый шприц объемом 0.3 мл соответствующий рассчитанный объем раствора poly(I:C).

Затем, взяв мышь за хвост, поместите ее на крышку клетки и зафиксируйте, захватив за загривок. Введите иглу срезом вверх в область между двумя верхними сосками под углом примерно 20 градусов по отношению к телу мыши и введите раствор poly(I:C). После этого верните мышь в клетку.

После проведения всех инъекций разместите клетки в тихом помещении с низкой проходимостью, чтобы избежать влияния сторонних факторов, и взвесьте мышей на следующее утро. Минимум за три дня до поведенческого тестирования замените подстилку в клетках взрослых потомков с иммунной активацией матери (MIA) в возрасте от 8 до 12 недель. За 30 минут до начала теста дайте мышам адаптироваться к условиям помещения для тестирования.

Для проведения теста на предожидательное торможение (PPI) зафиксируйте мышей в плексигласовых цилиндрах на пьезоэлектрическом датчике. Дайте мыши привыкнуть к камере для теста на предожидательное торможение в течение пяти минут, проведя шесть проб с белым шумом интенсивностью 120 децибел. Затем подвергните мышей воздействию рандомизированных комбинаций звуков, как указано в таблице, и сравните результаты с исходной старт-реакцией, чтобы определить степень предожидательного торможения у животных с MIA.

Для проведения теста в открытом поле поместите мышь в угол открытой квадратной арены с определенной центральной зоной размером 17 на 17 сантиметров и записывайте траекторию движения мыши в течение 10 минут с помощью камеры, закрепленной на потолке. Затем количественно определите количество заходов в центральную зону и время, проведенное в ней. Для проведения теста на закапывание шариков адаптируйте мышь к тестовой клетке с плотно уложенным чистым наполнителем из осины и сосны глубиной 5 сантиметров в течение 10 минут, затем верните мышь в домашнюю клетку и аккуратно разложите 20 темно-синих стеклянных шариков диаметром 1,5 сантиметра в виде сетки 4 на 5 в тестовой клетке.

Теперь верните мышь в тестовую клетку на 10 минут, затем поместите животное обратно в домашнюю клетку и подсчитайте количество стеклянных шариков, которые были зарыты в течение периода тестирования. Инъекция poly(I:C) на 12,5 эмбриональный день может вызвать острый воспалительный ответ в материнско-плацентарно-плодной оси и привести к хроническому воздействию на развитие мозга и поведенческие фенотипы. Действительно, poly(I:C) индуцирует более высокую экспрессию гена Il6 в селезенке матери, плаценте и мозге плода через три часа после инъекции.

В целом, по сравнению со взрослым потомством, получавшим физиологический раствор, वयस्कлые особи потомства после MIA реже заходят в центральную зону и проводят в ней меньше времени в тесте «открытое поле». Животные, которым вводили poly(I:C), также демонстрируют более частое зарывание объектов в тесте на зарывание стеклянных шариков и более низкий уровень предомиксового торможения. Другим характерным признаком потомства после MIA является утрата клеток Пуркинье в седьмой доле мозжечка: у этих животных в седьмой доле мозжечка наблюдается меньшее количество кальбиндин-положительных клеток Пуркинье по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что беременных мышей нельзя беспокоить после индукции MIA. Впоследствии для изучения дополнительных взаимодействий с окружающей средой можно индуцировать такие факторы, как постнатальный стресс или инфекция.