Комбинированный оптогенетика и сублимационной перелом реплики иммунноокрашивания по анализу Устройство ввода специфических рецепторов глутамата у мышей Amygdala

Целью этой процедуры, сочетающей оптогенетику с методом иммуномечения реплики с помощью замораживания и перелома, является анализ плотности ионотропных глутаматных рецепторов в синапсах миндалевидного тела мыши с идентифицированными пре- и постсинаптическими элементами. Высокая воспроизводимость и универсальность этого метода иммуномаркировки реплики с помощью замораживания и разрушения в сочетании с оптогенетикой предлагает очень мощный подход к коррелированному анализу структурных и функциональных свойств синапсов. Основными преимуществами данной процедуры являются: планарное представление пре- и постсинаптических элементов, а также количественный анализ белков в этих специализированных микродоменах.

Различные методы могут быть адаптированы к множеству различных тканей для изучения распределения и организации интегральных мембранных белков. Как правило, этот комбинированный оптогенетический подход FRIL является сложным для новичков из-за большого количества различных необходимых аппаратов и машин. Очень важно начинать модуляцию с помощью другого метода, так как некоторые другие шаги трудно освоить.

Например, дробление и репликация замороженных образцов: для начала этой процедуры приклейте корональный блок мозга мыши на держатель вибросреза. Сориентируйте тканевый блок так, чтобы неокортекс был обращен к вибрирующему лезвию. Затем разрежьте корональные срезы, содержащие миндалевидное тело, толщиной 140 микрометров в ноль целых один моляр, ледяной PB. И соберите их в шестилуночную чашку в том же буфере.

Под стереомикроскопом обрежьте интересующую область от срезов, в чашке Петри, покрытой силиконовым эластомером и заполненной нулем целых одного моляра PB. Затем перенесите обрезанный блок в раствор криозащиты и оставьте на ночь при температуре шесть градусов Цельсия. На этом этапе подготовьте медные носители для использования на последовательных этапах процедуры FRIL, отполировав их листом поддельной кожи в качестве средства для удаления потускнения. Под микроскопом прикрепите к медному носителю кольцо из двустороннего скотча, которое будет служить удерживающим колодцем для обрезанного блока.

Затем поместите обрезанный блок в отверстие двустороннего скотча с помощью петли из платиновой проволоки. Удалите излишки раствора криопротектора с помощью фильтровальной бумаги или щетки. После этого накройте держатель другой переноской.

Так, что тканевый блок зажат между двумя носителями. Чтобы заморозить образец, вставьте сэндвич-носитель в держатель для образцов. Затем вставьте держатель образца в морозильную установку под высоким давлением.

Запустите цикл замораживания, нажав кнопку jet-auto, немедленно снимите держатель образца и погрузите наконечник в изолированный бокс с жидким азотом. Затем осторожно извлеките бутерброд из держателя для образцов и поместите его в предварительно охлажденный криовалиал. Храните криовиалы, содержащие носители, в криотанке до репликации.

Перед установкой электронно-лучевой пушки снимите экран с дефлекторной пластиной. Поместите установочный шаблон для центрирования нити накала в цанговый патрон через нижнюю крышку катода. Далее наденьте новую нить на манометр, пока пластины давления не зажмут концы нити.

Затем снимите установочный указатель и вставьте угольный стержень. Исправьте его, затянув цанговый патрон держателя стержня испарителя. Следя за тем, чтобы высота конца стержня была на середине второй катушки снизу.

После этого установите на место пластину дефлектора, и вставьте электронно-лучевой пистолет в блок замораживания-разрушения. В этой процедуре отрегулируйте ток и напряжение для испарения. Затем вставьте замороженный сэндвич с носителем в таблицу с двойной репликацией в жидкий азот.

Затем перенесите двойную реплику стола в сосуд Дьюара и закрепите его на приемнике ступени образца под углом 45 градусов. Подбирайте стол с двойной репликой с помощью настольного манипулятора. Вставьте его в установку замораживания-разрушения на холодную сцену и подождите примерно 20 минут, чтобы температура стола с двойной копией стабилизировалась до минус 115 градусов по Цельсию.

После этого разломайте ткань, вращая вручную против часовой стрелки колесо, которое соединено с кожухом над столом с двойной копией. Когда кожух поворачивается, он заставляет стол с двойной репликой открыться, что приводит к разрыву ткани. На трещиноватые поверхности наносится слой углерода под углом 90 градусов.

Затем извлеките реплицированные образцы из таблицы с двойной репликацией и перенесите их на керамическую 12-луночную пластину, заполненную TBS. С помощью платиновой петли-проволочной катанки удалите репликированную ткань из держателя образца. Для разложения SDS перенесите реплику в стеклянный флакон объемом четыре миллилитра, наполненный одним миллилитром буфера для SDS-разложения.

Дайте ему настояться в течение 18 часов при температуре 80 градусов Цельсия, встряхивая. Для иммуномаркировки промойте реплику в течение 10 минут в свежем буфере для SDS-разложения. Затем инкубируйте его с первичными и вторичными антителами, разведенными в 2% BSA-TBS, во влажной камере при температуре 15 градусов Цельсия в течение 24-72 часов.

После этого установите реплику на 100-строчную параллельную стержневую сетку с дальним покрытием. Изобразите реплику с помощью просвечивающего электронного микроскопа при напряжении 80 или 100 киловольт. Затем получите цифровые изображения с помощью ПЗС-камеры.

Когда он находится в автономном режиме, найдите соответствующие области на изображении из реплики, используя разные ориентиры. Через четыре недели после инъекции AAV, для экспрессии Channelrhodopsin-2 в задней группе таламических ядер, Channelrhodopsin-2 эффективно транспортируется антероградно по аксонам таламуса и достигает интеркалированных клеточных масс миндалевидного тела. Постсинаптическая специализация глутаматергических синапсов может быть распознана в реплике как кластер внутримембранных частиц на Е-лице плазматической мембраны и часто сопровождается Р-гранью ее пресинаптического элемента.

Здесь рецепторы Channelrhodopsin-2 и глутамата были визуализированы с использованием частиц золота разного размера, конъюгированных с вторичными антителами. Из-за отсутствия структурных или молекулярных инструментов для определения на одной и той же реплике, принадлежит ли постсинаптическая мембрана интеркалированным нейронам. Соответствующая реплика была помечена для мю-опиоидных рецепторов, маркеров для этих нейронов.

В качестве примера количественного анализа плотности глутаматных рецепторов в этих синапсах приведем диаграммы рассеяния количества частиц золота для рецепторов ампы в зависимости от синаптической площади на шипах и дендритах. Которые выявляют положительную корреляцию в обеих структурах. При выполнении этой процедуры важно помнить, что отдельные шаги сильно взаимозависимы.

Поэтому ошибка в одном из этапов может поставить под угрозу всю процедуру. Просмотр большой части специализаций плазматических мембран на двумерной поверхности реплики позволяет исследовать пространственное распределение и физическую непрерывность молекул, представляющих интерес, без трудоемкой и трудоемкой реконструкции серийных срезов артрофинов. Этот подход может быть использован другими исследователями для получения представления о структурно-функциональных отношениях конкретных синапсов в нейронных цепях.

Где он распутывает происхождение входных данных и природу постсинаптических элементов. Это важно, но проблематично.