Комбинированный 3D Tissue Engineered In Vitro / В Silico Lung Опухоль модель для прогнозирования эффективности наркотиков в конкретных мутационные Backgrounds

Общие цели этой комбинированной модели рака легких in vitro и in silico заключаются в изучении чувствительности таргетной терапии немелкоклеточного рака легкого и прогнозировании эффективности новых веществ. Эта система 3D-моделирования позволяет отслеживать реакцию конкретных клеток на таргетное лечение или прямые комбинации. Основное преимущество этого метода заключается в том, что предсказания in silico могут облегчить доклинические испытания лекарств в более физиологически релевантной среде.

Применение этого метода распространяется на терапию различных опухолевых образований, поскольку он может быть использован для оптимизации прогнозирования ответа на лекарственные препараты на основе конкретных мутационных фонов. Демонстрировать процедуру будет Франциска Шмитт, научный сотрудник нашей лаборатории. Чтобы создать динамическую культуру, начните с культивирования модели опухоли в условиях статического культивирования в клеточной коронке при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в обычном инкубаторе.

Через три дня соберите автоклавный биореактор и вставьте в систему засеянный биологический подслизистый слой тонкой кишки плюс слизистую оболочку. Далее добавьте в колбу 45 миллилитров RPMI, дополненных соответствующим количеством FCS, и подсоедините безыгольное устройство для отбора проб к системе трубок между биореактором и колбой со средой. Поместите биореактор в инкубатор и подключите его к насосу для культивирования модели опухоли в течение дополнительных 14 дней с постоянным потоком среды три миллилитра в минуту.

Для лечения статической модели опухоли с помощью гефитиниба на 11-й день посева в обычном инкубаторе сначала используют пастерскую пипетку для удаления старой среды из лунок. Затем добавьте по одному миллилитру свежеприготовленного препарата RPMI, дополненного FCS и гефитинибом, внутрь каждой клеточной коронки и по 1,5 миллилитра на дно каждой лунки. Чтобы собрать образцы Elisa из динамической культуры, на 11-14 день культивирования прикрепите шприц к устройству для отбора проб и удалите один миллилитр среды из системы биореактора.

Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет выполнен иммуноферментный анализ. Чтобы определить количество положительных ядер Ki67, сначала с помощью инвертированного микроскопа можно получить пять DAPI и пять окрашивающих Ki67 флуоресцентных изображений 2D-культур с 20-кратным увеличением каждого условия из неперекрывающихся участков образца. Чтобы вручную подсчитать положительные ядра Ki67, откройте появившееся изображение на Фиджи и выберите «Плагины» и «Счетчик клеток», затем нажмите «Инициализировать», выберите тип счетчика и нажмите на каждое положительное ядро Ki67.

Количество нажатых ячеек появится рядом с выбранным типом счетчика. Для автоматического подсчета ячеек общего числа ядер в 2D-изображениях запустите макрорегистратор, откройте изображение DAPI и нажмите изображение, введите и 8-бит, затем нажмите усилить контраст и установите насыщенный параметр на единицу и нормализуйте. Чтобы повысить резкость изображения, установите маску нерезкости, используя радиус единицы и маску 60.

Чтобы связать изображение, нажмите на автоматический порог и выберите метод Рени/Энтропия с белыми объектами на черном фоне. Затем нажмите «Плагины», затем «BioVoxxel» и «Нерегулярный водораздел» с радиусом эрозии пять, чтобы разделить клетки. Нажмите «Анализировать» и «Проанализировать частицы», установите размер на 02 бесконечность и проверьте суммировать.

Количество ячеек будет отображаться в сводной таблице в виде подсчетов. Затем нажмите кнопку «Создать», чтобы сохранить макрос и обеспечить автоматический подсчет ядер в дальнейших 2D-изображениях клеточных культур. После использования баз данных для создания опухолевой сети откройте соответствующее программное обеспечение для сетевого анализа, нажмите кнопку «Файл» и «Создать» и введите модели опухолей Юпитера.

Нажмите OK, чтобы создать новую сеть, затем кликните, квадрат крупным планом North и OK, чтобы визуализировать рецептор в двойной мембране. Чтобы визуализировать узлы в виде прямоугольников, щелкните «Общий белок», затем EGFR, затем Ok.To пометьте узлы в сети, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы изменить цвет и форму, и установите цветовые коды узлов, как указано. Чтобы визуализировать параметры считывания в виде шестиугольников, выберите, фенотипизируйте, введите пролиферацию и нажмите OK.

Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Изменить цвет и форму» еще раз, чтобы установить цветовой код на 255, 204, 204. Чтобы визуализировать края взаимодействий узлов, щелкните «Переход состояния» для стрелок активации и «Запрет» для притупленных стрелок блокирования. Затем нажмите «Файл» и «Сохранить как», а затем сохраните сгенерированную сигнальную сеть как models.xml опухоли Юпитера.

Для анализа равновесия системы в стационарном состоянии откройте программное обеспечение SQUAD, нажмите кнопку «Загрузить сеть» и загрузите файл models. xml опухоли Юпитера. Нажмите, запустите анализ.

Чтобы написать протокол моделирования, нажмите «Дополнительно» и «Пертубатор», затем нажмите «Редактировать протокол», чтобы смоделировать сопротивление anit-EGFR. Далее щелкаем по пертубации и выбираем стандартное начальное состояние, равное установившемуся состоянию четыре. Нажмите кнопку «Добавить», чтобы добавить новый постоянный импульс, затем выберите параметр состояния и установите цель на FLIP, время на ноль и значение на 4.

Нажмите кнопку «ОК» и установите состояния для c-MET и Гефитиниба таким же образом. Чтобы задать значение состояния активному узлу EGFR, нажмите кнопку Активный узел, а затем нажмите кнопку Изменить. Установите состояние на 8 и нажмите OK.

Нажмите OK, чтобы сохранить протокол. Чтобы отобразить конкретные кривые, на панели параметров выберите EGF-EGFR, звезду EGF-EGFR, звезду Mek, каспазы, PI3K, гегитиниб, апоптоз, пролиферацию, ингибитор MEk и ингибитор PI3K. Затем нажмите кнопку «Инициализировать» и «Выполнить», чтобы начать полное моделирование реакции системы.

Чтобы смоделировать комбинированное лечение ингибиторами PI3K и Mek, нажмите «Редактировать протокол». Затем, используя тот же параметр узла, что и только что продемонстрированный, нажмите кнопку пертубации, а затем добавьте add, чтобы добавить новый постоянный импульс. Затем выберите параметр состояния и установите целевой показатель на ингибитор PI3K, время на ноль и значение на единицу, а затем нажмите OK.

Нажмите кнопку Add еще раз, чтобы добавить еще один новый постоянный импульс, и в параметре state установите цель на ингибитор Mek, установите время на ноль и значение на единицу, а затем нажмите OK, а затем снова OK, чтобы сохранить протокол. Под панелью параметров, используя те же узлы для графического представления, что и только что показанные, нажмите кнопку «Инициализировать» и запустите для запуска полного моделирования реакции системы. Затем, чтобы завершить моделирование, нажмите кнопку «Сброс».

Эта 3D-система тестирования опухолей, облегчает определение индекса пролиферации. И количественная оценка апоптоза с помощью M30 Elisa. В этом репрезентативном эксперименте, например, только мутировавшие EGFR опухолевые клетки HCC827, инкубированные в условиях статического культивирования, реагировали на ингибирование эпидермального фактора роста.

С помощью ингибитора тирозинкиназы, гефитиниба, о чем свидетельствует увеличение апоптоза, наблюдаемое в модельной системе опухоли HCC827. Здесь показаны репрезентативные изображения статических 3D-моделей опухолей, с индуктором эпителиально-мезенхимального перехода или без него, моделирование TGF-beta-1. Обратите внимание на увеличение экспрессии виментина в обработанных культурах опухолевых клеток.

В динамических условиях гефитиниб оказывает сильное воздействие на мутировавшие EGFR клетки HCC827, о чем свидетельствует уменьшение тканеподобных структур в присутствии ингибитора тирозинкиназы по сравнению с необработанной контролируемой культурой. На этом графике наблюдается моделирование известного драйва мутации, коактивации EGFR и c-MET, а также увеличения скорости пролиферации и снижения скорости апоптоза в клетках HCC827 с течением времени, что отражает индуцированную гефитинибом резистентность, которая коррелирует с активацией MEK и PI3K. Действительно, моделирование комбинированных ингибиторов PI3K и MEK приводит к обращению вспять эффекта резистентности к анти-EGFR, снижению пролиферации и индукции апоптоза.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как Вестерн-блоттинг или для исследования нисходящих сигнальных путей. Кроме того, системы совместного культивирования с различными типами клеток также могут быть использованы для анализа перекрестных помех между различными клетками в опухолевом микроокружении. Этот метод прокладывает путь для исследователей в области разработки лекарств для изучения эффективности лекарств in Silico.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как прогнозировать эффективность лекарств в стратифицированных группах пациентов, моделируя сигнальные изменения и анализируя результирующие реакции системы при различных мутациях и фонах.