Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

Общая цель данного протокола LAM заключается в изоляции специфических растительных клеток для получения высококачественной РНК для транскрипционного анализа. Основное внимание уделяется труднодоступным клеткам, таким как яйцеклетки, у половых и апомиктических видов boechera. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетики развития растений, такие как транскрипционная основа, лежащая в основе полового и бесполого размножения растений семенами.

Основным преимуществом данного метода является возможность выполнения определенных специфических типов анализа. Это позволяет преодолеть эффект маскирования транскриптов редких типов клеток при анализе тканей, пораженных атерогенезом. Для начала процедуры с помощью станции для заливки заполните предварительно прогретый свежий пластиковый лоток для балансировки расплавленным парафином при 56 °C.

Поднимите крышку парафиновой ванны и извлекайте кассеты по одной. Перенесите образец в уравновешивающий лоток с жидким парафином при температуре 56 °C. Действуйте быстро, чтобы избежать застывания парафина вокруг образца во время манипуляций с кассетой.

Затем с помощью препаратальной иглы расположите образец в соответствии с планом эксперимента. Повторяйте процедуру до переноса всех образцов. Для подготовки тонких срезов для LAM удалите парафин с образца из пластикового кювета на световом столе.

Вырежьте из воскового блока фрагмент, содержащий образец, например, почку или цветок, используя лезвие, свободное от РНКаз. Затем расплавьте небольшую каплю парафина на кончике шпателя. Используйте горячий воск, чтобы зафиксировать блок с включенным в него образцом на подложке.

Удалите излишки парафина вокруг образца с помощью лезвия бритвы и убедитесь, что блок имеет квадратную поверхность с параллельными краями. Затем установите температуру нагревательной плитки на 42 °C. Аккуратно закрепите образец в микротоме.

Подготовьте срезы толщиной семь микрометров клеток зрелого гаметофита boechera. Затем перенесите парафиновые ленты длиной от 10 до 15 сантиметров в пластиковый контейнер с черным картоном на дне, после чего разместите их на предметных стеклах для LAM. Чтобы подготовить стекла для LAM, поместите от пяти до десяти предметных стекол в металлическом обрамлении на нагревательную плитку плоскими поверхностями вверх.

Пипеткой нанесите один-два миллилитра воды, не содержащей РНКаз, на пластиковую часть предметных стекол. С помощью лезвия бритвы разрежьте парафиновые ленты на короткие фрагменты длиной примерно четыре-пять сантиметров. Они должны быть достаточно длинными, чтобы перекрывать пластиковые окна предметных стекол.

Затем с помощью пинцета и препаровальной иглы расположите парафиновые полоски параллельно друг другу на пластиковом окошке предметных стекол. Осторожно приподнимите один край стекол, чтобы удалить воду, и верните их на место. Накройте нагревательную плитку пластиковой крышкой, не касаясь стекол, убедившись, что крышка обеспечивает воздухообмен.

Высушите предметные стекла при 42 °C в течение ночи. В вытяжном шкафу проведите депарафинизацию стекол в ксилоле дважды по 10 минут. Убедитесь, что погружена только пластиковая часть стекол, а широкий край металлической рамки каждого стекла остается сухим для удобства извлечения.

Перед проведением LAM дайте предметным стеклам высохнуть в течение 10 минут в вытяжном шкафу. В данной процедуре включите компьютер и микроскоп для LAM. Затем запустите программу управления микроскопом и лазером.

Включите блок управления лазером и активируйте лазер, нажав соответствующую кнопку на блоке управления. Затем поместите колпачок в держатель для колпачков. Поместите LAM-препарат на предметное стекло для микроскопии, убедившись, что плоская поверхность препарата с прикрепленными тканями обращена к предметному стеклу.

Затем поместите предметное стекло в прибор, подложив под него стеклянную пластину. В завершение установите в прибор держатель с колпачком. Выберите объектив 4x.

В программе переместите колпачок в верхнее положение. После этого выполните сканирование предметного стекла. Просмотрите полученный скан и определите интересующие вас структуры.

Определите и сохраните их координаты на предметном стекле, чтобы иметь возможность вернуться в точное положение на этапе вырезания. Затем выберите подходящий объектив. Проверьте положение лазера, один раз нажав кнопку лазерного импульса.

В идеале следует выбирать участок мембраны без ткани. Удерживая колпачок в нижнем положении, используйте инструмент «ручка» (hand pen tool), чтобы отметить границы интересующего типа клеток или ткани. Например, яйцеклетки.

Выполните диссекцию с помощью лазера, нажав кнопку Cut. Для изоляции отдельных клеток крайне важно четко идентифицировать их в соответствующих срезах. Кроме того, диаметр клеток должен составлять не менее 8 µm, чтобы сделать возможным проведение специфического для данного типа клеток анализа транскрипции.

Обратите внимание, что серийный срез необходимо повторить, если граница вокруг клетки была вырезана не полностью, что обычно видно на экране. В таком случае рекомендуется настроить программное обеспечение на автоматическое выполнение двух повторов среза в качестве стандарта. После этого поднимите колпачок и перейдите к следующей позиции сохранения с интересующей структурой, и вырезайте следующий срез клетки до тех пор, пока не будут собраны все интересующие клетки с одного предметного стекла.

Убедитесь, что колпачок расположен таким образом, чтобы новый срез прикрепился к пустой позиции на колпачке. После того как интересующие типы клеток со всех предметных стекол будут изолированы, извлеките предметное стекло из прибора. Переведите держатель колпачка в нижнее положение и визуально осмотрите поверхность колпачка.

Используйте объектив 4x, чтобы исключить неспецифические загрязнения образца. Затем закройте крышку. Заморозьте сухие срезы при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

Ниже представлена схематическая схема зрелого женского гаметофита. Представлены тонкие срезы семяпочек, содержащих женские гаметофиты *Boechera divaricarpa*, в которых яйцеклетки четко идентифицируются благодаря характерной морфологии женского гаметофита. Анализ показал, что качество РНК, полученной из срезов яйцеклеток, было аналогичным качеству РНК из более крупных участков ткани, взятых с тех же предметных стекол в качестве контроля.

Достигнутое качество РНК было подходящим для секвенирования РНК с разрешением до конкретных типов клеток, что позволило выявить 236 генов, экспрессирующихся в апомиктической яйцеклетке, но не в апомиктической центральной клетке, синергиде или апомиктической начальной клетке. Также эти гены не экспрессировались в клетках зрелого полового гаметофита arabidopsis thaliana. Для поиска ответов на дополнительные вопросы генетики развития можно проводить профилирование других типов клеток и тканей различных видов.

Например, молекулярные основы импринтинга в эндосперме и зародышах семян растений. После освоения данной методики исследователи в области генетики развития и репродукции растений смогут изучить транскрипционную основу апомиктического размножения у рода Boechera. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получить высококачественную РНК для анализа транскрипции в конкретных типах клеток с помощью лазерной микродиссекции.