Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Общая цель этого экспериментального протокола заключается в том, чтобы изобразить развитие эмбриона рыбки данио в световом микроскопе и обработать полученный набор данных multiview в Figi с помощью плагина приложения для реконструкции multiview. Этот метод может помочь вам понять морфогенетические события в развитии животных. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно наблюдать морфогенетические события в развивающемся в такте эмбрионе с высоким пространственным и временным разрешением.

Основными преимуществами световой листовой микроскопии являются низкая фототоксичность метода, быстрое время, с помощью которого вы можете получить изображение образца, и то, что вы можете получить изображение образца под различными углами, так называемые виды. Захват образца с разных ракурсов позволяет нам преодолеть деградацию сигнала и заданной оси. Эти различные изображения затем могут быть использованы и зарегистрированы с помощью флуоресцентных микросфер вокруг образца.

Мы можем реконструировать трехмерный объем, достигая изотропного разрешения. Несмотря на то, что мы демонстрируем использование флуоресцентной микроскопии световых листов для развития глаз рыбок данио, этот метод также может быть использован для ответа на различные вопросы в биологии развития и нейробиологии с использованием различных модельных организмов. Для начала вкрутите объектив обнаружения в микроскоп, не закрывая осветительные объективы.

Затем снимите крышки с объективов и осторожно вставьте камеру с образцом в микроскоп. Закрепите камеру, затянув винт. Затем подключите температурный щуп и блок Пельтье к микроскопу.

Две трубки, по которым циркулирует охлаждающая жидкость для блока Пельтье, совместимы с обоими разъемами и могут работать в любой ориентации. Далее с помощью шприца загрузите камеру через шприц раствором до верхнего края окон камеры и проверьте на герметичность. Теперь включите микроскоп, компьютер и инкубацию.

Запустите операционное программное обеспечение микроскопа и установите температуру инкубации на уровне 28,5 градусов Цельсия. Пока требуется температура в течение часа, подготовьте образец. Начните с подготовки агарозы.

Растопите подготовленный один миллилитр аликвоты 1% низкой температуры плавления агарозы в Е трех средах при 70 градусах Цельсия. Примерно через 15 минут перелейте 600 микролитров расплавленной агарозы в свежую 1,5-миллилитровую пробирку и добавьте 250 микролитров Е трех сред, 50 микролитров 0,4% MS 222 и 25 микролитров вихревого раствора флуоресцентных шариков. Поместите трубку в нагревательный блок при температуре около 39 градусов Цельсия, чтобы агароза приблизилась к точке гелеобразования.

Затем протолкните плунжеры с тефлоновыми наконечниками вниз на дно стеклянных капилляров внутреннего диаметра в один миллиметр. Приготовьте пять таких штук. Теперь кратковременно перемешайте агарозную смесь и затем перенесите в нее пять эмбрионов с минимальным количеством жидкости.

Затем вставьте капилляр и аспирируйте один эмбрион головой вперед. Голова должна войти раньше хвоста и никаких пузырьков воздуха быть не может. Наберите достаточное количество раствора так, чтобы над зародышем было около двух сантиметров агарозы, а ниже него – один сантиметр агарозы.

Прежде чем продолжить, втяните по одному эмбриону в каждый капилляр. Для освоения этого шага требуется некоторая практика. Готовятся к нему, используя неценные эмбрионы.

Когда агароза полностью застынет, храните образцы в среде Е 3, подкладывая капилляры к стенке стакана пластилином с отверстием дна в растворе. Теперь соберите держатель для образца. Сначала вставьте в стебель две пластиковые втулки нужного размера друг против друга.

Разрезы на рукавах должны быть обращены наружу. Далее прикрепите зажимной винт. И вставьте капилляр через держатель до тех пор, пока с другой стороны не станет видна полоса черного цвета.

Не прикасайтесь к поршню. Затем затяните зажимной винт. Далее вытолкните из капилляра сантиметр агарозы и обрежьте его.

Затем вставьте стержень в диск держателя образца. Перед загрузкой диска с образцами убедитесь, что столик находится в крайнем верхнем положении в управляющем программном обеспечении. Затем с помощью направляющих направляющих переместите держатель и спустите образец в микроскоп.

Теперь представьте выбранный образец, как описано в текстовом протоколе. Обработка данных производится в Figi. Это дистрибутив ImageJ.

Перед началом работы Figi следует обновить. Сохраните полученный набор данных изображения в одной папке. Промежуточные файлы обработки изображений будут сохранены в этой же папке.

Теперь запустите приложение для реконструкции нескольких видов. Затем определите новый набор данных. Выберите опцию Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats и создайте имя для файла выходных данных.

Затем выберите первый файл CZI из набора данных. Метаданные будут загружены автоматически. В метаданных изображения убедитесь, что количество углов, каналов, источников освещения и размер вокселя установлены правильно.

При нажатии OK открывается окно журнала, окно проводника настроек представления и окно консоли. Обозреватель с настройками вида предоставляет удобный интерфейс. Выберите файлы, которые необходимо обработать, и нажмите правую кнопку мыши.

Откроется новое окно, показывающее различные этапы обработки по мере их выполнения. В правом верхнем углу находятся кнопки информации и сохранения. Info отображает сводку содержимого сохраненного файла данных, а нажатие кнопки «Сохранить» сохранит результаты обработки.

В противном случае программа не сохраняет результаты этапов обработки. Чтобы повторно сохранить весь набор данных, сначала выберите все файлы, нажав Ctrl+A и щелкнув правой кнопкой мыши. Затем выберите «Повторно сохранить набор данных» и «Как HDF5».

После этого необходимо отметить галочкой подтверждение действия повторного сохранения. Через несколько минут, для каждого момента времени, программа укажет, когда восстановление завершено. Затем перейдите к обнаружению точек интереса в данных.

Выделите все временные точки, нажав Ctrl+A и щелкнув правой кнопкой мыши. Для выбора определите точки интереса. Из предложенных вариантов выберите разность по Гауссу.

И выберите и уменьшите образцы изображений перед сегментацией. В следующем окне выберите настройки обнаружения. Из вариантов локализации субпикселей выберите 3-мерную квадратичную аппроксимацию.

Затем в спецификации точки интереса выберите Интерактивный. Для параметра понижающей выборки XY выберите «Соответствие разрешению Z». А для нижней выборки Z выберите 1x.

Затем выполните операцию, выбрав параметр Java, использующий вычисления на ЦП. Во всплывающем окне выберите один вид для проверки параметров. Как только вид загрузится, отрегулируйте яркость и контрастность, нажав Ctrl+Shift+C на клавиатуре.

Кроме того, для обнаружения бусин включите опцию поиска максимумов зеленого цвета. Теперь обратите внимание на сегментацию в виде зеленого кольца вокруг обнаружений. Отрегулируйте разность значений Гауссиана для сигма один и пороговых параметров, чтобы оптимально сегментировать бусины с минимальным количеством ложных срабатываний.

Каждая бусина должна быть обнаружена только один раз. После определения оптимальных параметров нажмите «Готово». После того, как компьютер загрузит каждый отдельный вид временной точки и сегментирует бусины, программа выводит файл журнала с количеством бусин, обнаруженных за один просмотр.

На один просмотр должно приходиться от 600 до нескольких тысяч бусин. В противном случае параметры детектирования нуждаются в доработке. Это сложный процесс.

Пирамида обнаружения редко бывает точной с первой попытки, а сбросы могут варьироваться в зависимости от временных точек одного фильма. Расслабление свежей информации обнаружит все настоящие бусины и позволит большему количеству ложных срабатываний может помочь. Если ни одна комбинация пирамиды не работает, то необходимо получить новый набор данных с использованием других флуоресцентных шариков.

Теперь перейдем к регистрации обнаружений и выполним деконволюцию с несколькими представлениями из стека. LSFM является идеальным методом визуализации процессов развития в различных масштабах от межклеточных структур до клеток и целых тканей в течение длительных периодов времени. С высоким разрешением могут быть зафиксированы очень быстрые межклеточные события, такие как рост микротрубочек в клетках-предшественниках нейроклеток.

С помощью видеоролика с одним просмотром можно количественно оценить рост микротрубочек. Внутриклеточные структуры могут быть прослежены в течение многих часов, такие как центросома в ганглиозных клетках сетчатки. Поведение отдельных клеток может быть извлечено из изображений всей ткани, таких как транс-расположение ганглиозной клетки на сетчатке.

Деконволюция с несколькими представлениями создает один изотропный стек Z путем объединения нескольких различных представлений с помощью функции распределения точек. Это обеспечивает значительно улучшенное изображение по сравнению с одиночными представлениями или средневзвешенными слияниями. Например, превращение оптического везикулы в оптическую чашу можно изучать по оптическим срезам в различных ориентациях с помощью показанного набора данных.

Кроме того, в целом заметно хорошее качество изображения, даже глубоко внутри эмбриона. Например, при просмотре морфогенеза зрительной чашки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как монтировать изображение эмбрионов данио-рерио в световой листовой микроскоп.

И как обрабатывать многовидовые наборы данных в Figi. После освоения потребуется около двух часов, чтобы начать эксперимент с замедленной съемкой на световом листовом микроскопе. Последующий анализ данных займет значительно больше времени.

Для этой задачи может быть полезно использовать компьютерный кластер. Более практические советы, советы по устранению неполадок и ссылки на другие ресурсы можно найти в текстовом протоколе. До начала эксперимента должно быть достаточно места для хранения данных и четкий план обработки данных.

Если у вас возникнут какие-либо проблемы, вопросы или будущие запросы, обратитесь к соответствующему веб-сайту функций или сообщите о проблемах в соответствующих репозиториях github.