Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в

Общая цель данной процедуры — визуализация деградации стационарной популяции определенного белка в Saccharomyces cerevisiae. Этот метод может быть использован для определения генетических требований и влияния факторов окружающей среды на деградацию интересующего белка. Основным преимуществом данного метода является отсутствие необходимости в использовании радиоактивных изотопов и длительных этапов иммунопреципитации, в отличие от методов пульс-погони, которые также применяются для визуализации деградации белков.

Данную процедуру можно использовать для анализа как эндогенного белка дрожжей, так и белка, экспрессируемого из плазмиды. В последнем случае штамм дрожжей трансформируют плазмидой, кодирующей интересующий белок, согласно стандартному протоколу трансформации дрожжей. Инокулируйте дрожжи в пять миллилитров подходящей среды.

Инкубируйте в течение ночи при 30 °C с перемешиванием. На следующее утро измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD600) каждой ночной культуры. Разведите культуры до OD600 0,2 в 15 мл свежей среды.

Инкубируйте при 30 °C с перемешиванием до достижения клетками середины логарифмической фазы роста. Пока дрожжевые клетки растут, подготовьтесь к процедуре «погони» с циклогексимидом (cycloheximide chase). Настройте термоблок для конических пробирок объемом 15 мл на 30 °C для инкубации клеток в присутствии циклогексимида.

Для обеспечения эффективного распределения тепла по культурам добавьте воду в каждую лунку термоблока таким образом, чтобы при вставке конической пробирки объемом 15 мл уровень воды поднимался до края лунки, но не переливался через него. Установите температуру второго термоблока, подходящего для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл, на 95 °C для денатурации белков после лизиса клеток. Предварительно прогрейте свежую ростовую среду до 30 °C.

Для каждой временной точки каждой анализируемой культуры требуется 1,1 мл среды. Добавьте 50 мкл 20-кратного стоп-микса (Stop Mix) в предварительно промаркированные микроцентрифужные пробирки. Подготовьте по одной пробирке для каждой временной точки каждой анализируемой культуры.

Поместите пробирки на лед. Когда клетки дрожжей достигнут середины логарифмической фазы роста, соберите 2,5 единиц OD600 каждой культуры для каждой временной точки анализа. Одна единица OD600 соответствует количеству дрожжей в одном миллилитре культуры при значении OD600, равном 1,0.

Центрифугируйте собранные клетки в конических пробирках объемом 15 миллилитров при 3, 000 ×g при комнатной температуре в течение двух минут. Удалите супернатант. Ресуспендируйте каждый клеточный осадок в одном миллилитре свежей ростовой среды с температурой 30 °C на каждые 2.5 единиц OD600 клеток.

Перед началом гонимого анализа с циклогексимидом уравновесьте суспензии дрожжевых клеток, инкубируя их в термоблоке при 30 °C в течение пяти минут. Самым сложным аспектом данной процедуры является соблюдение времени добавления циклогексимида и сбора клеток для каждого образца. Для обеспечения успеха мы составляем график добавления циклогексимида и сбора клеток и строго его придерживаемся.

Для начала эксперимента по изучению деградации белков (cycloheximide chase) нажмите кнопку «Start» на таймере. Быстро, но осторожно добавьте циклогексимид до конечной концентрации 250 µg/mL в первую суспензию клеток дрожжей и кратковременно перемешайте на вортексе. Немедленно перенесите 950 µL (или примерно 2,4 единицы OD600) суспензии клеток дрожжей с добавленным циклогексимидом в предварительно маркированную микроцентрифужную пробирку, содержащую 50 µL ледяного 20-кратного Stop Mix.

Перемешайте микроцентрифужную пробирку на вортексе и поместите на лед до завершения сбора всех образцов. Начните процедуру «чейза» с циклогексимидом для каждой из оставшихся суспензий дрожжевых клеток через регулярные интервалы времени, как показано в инструкции. В каждой последующей временной точке перемешайте суспензии дрожжевых клеток на вортексе и перенесите 950 microliters в промаркированные микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 microliters предварительно охлажденного 20x Stop Mix.

Перемешайте на вортексе и поместите собранные клетки на лед. Чтобы предотвратить оседание клеток дрожжей, перемешивайте клеточные суспензии в конических пробирках объемом 15 мл на вортексе примерно каждые пять минут на протяжении всего периода追い-фазы (chase). После сбора всех образцов осадите клетки путем центрифугирования при 6 500 ×g и комнатной температуре в течение 30 секунд.

Удалите супернатант с помощью пипетирования или аспирации. Теперь клетки готовы к щелочному лизису. Подготовьте клетки к щелочному лизису, добавив по 100 µL дистиллированной воды к каждому осадку клеток, и ресуспендируйте их путем пипетирования вверх-вниз.

Добавьте 100 µL 0,2 M гидроксида натрия в каждый образец. Перемешайте с помощью вортекса. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение пяти минут.

На данном этапе клетки дрожжей не были лизированы, и белки не были высвобождены. Далее осадите клетки путем центрифугирования при 18, 000 ×g при комнатной температуре в течение 30 секунд. Удалите супернатант с помощью пипетки или аспирации.

Для лизиса клеток добавьте по 100 µL буфера для образцов по Лэммли в каждый осадок клеток. Ресуспендируйте содержимое, перемешивая раствор пипетированием. Инкубируйте при 95 °C в течение пяти минут для полной денатурации белков.

Центрифугируйте лизаты при 18 000 ×g при комнатной температуре в течение одной минуты для осаждения нерастворимых веществ. Супернатант, представляющий собой solubilized extracted protein, готов для разделения методом SDS PAGE и последующего анализа методом вестерн-блоттинга. В качестве альтернативы лизаты можно хранить при −20 °C.

Стабильность Deg1-Sec62, модельного субстрата системы деградации белков, ассоциированной с эндоплазматическим ретикулумом дрожжей, анализировали методом циклогексимидного чейза. Белок Deg1-Sec62 мигрирует при SDS-PAGE в виде нескольких фракций и легко подвергается деградации в клетках дикого типа. Pgk1 использовали в качестве контроля загрузки, поскольку его содержание не меняется в исследуемых условиях.

Потеря либо резидентной в ЭР убиквитинлигазы hrd1, либо убиквитин-конъюгирующего фермента ubc7 существенно стабилизировала белок Deg1-Sec62, что подтверждает ранее наблюдавшуюся роль этих белков в деградации Deg1-Sec62. Cue1 представляет собой трансмембранный белок, который заякоривает ubc7 на мембране ЭР и активирует фермент, однако необходимость в cue1 для деградации Deg1-Sec62 ранее напрямую не изучалась. Результаты данного исследования, показавшие стабилизацию Deg1-Sec62 в отсутствие cue1, подтвердили роль cue1 в ЭР-ассоциированной деградации Deg1-Sec62.

Результаты вестерн-блоттинга были количественно определены с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Для сравнения содержания белка Deg1-Sec62 в образцах для каждого образца было рассчитано отношение скорректированных интенсивностей сигнала Deg1-Sec62 к Pgk1. Важно помнить, что эта процедура наиболее точно отражает кинетику деградации стационарной популяции интересующего белка.

Для визуализации деградации недавно синтезированной популяции интересующего белка можно использовать другие методы, такие как эксперименты с импульсным мечением и вымыванием (pulse-chase). Не забывайте, что циклогексимид и азид натрия чрезвычайно токсичны, поэтому при выполнении данной процедуры следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта с этими химическими веществами.