Последовательное применение покровные стекла для оценки сжимающей Жесткость объектива мыши: Штамм и Морфометрические анализы

Общая цель этой процедуры заключается в оценке сжимающей жесткости и геометрии линз мыши с использованием простого и недорогого подхода. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области объективов. Например, как различные генетические и экспериментальные возмущения влияют на биомеханические свойства хрусталика.

Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она точна, воспроизводима и не требует дорогостоящего или специализированного оборудования. Этот метод дает представление о свойствах линз мышей с потенциалом применения к более крупным модельным организмам, таким как крысы и кролики. Визуализация метода имеет решающее значение, потому что этапы рассечения хрусталика и нанесения покровного стекла трудно изучить без демонстрации.

Демонстрировать процедуру будет Кэтрин Ченг, постдок из моей лаборатории. Начните рассечение с помощью изогнутых щипцов, чтобы сжать ткань вокруг глаза усыпленной мыши, выведя глаз из глазницы. Затем удалите глаз и поместите его в чашку для вскрытия, содержащую свежий PBS, под препарирующим микроскопом.

Отрежьте зрительный нерв как можно ближе к глазному яблоку. И аккуратно и осторожно ввести тонкий, прямой пинцет в глазное яблоко через отверстие, где зрительный нерв выходит из задней части органа. Аккуратно сделайте разрез ножницами от задней части до края роговицы, стараясь не повредить хрусталик.

Продолжайте разрез вдоль соединения между роговицей и склерой, по крайней мере, на полпути вокруг глазного яблока. И аккуратно надавите на роговицу, чтобы снять линзу с глаза через отверстие. Затем с помощью прямых щипцов с тонкими наконечниками осторожно удалите любой крупный мусор, который все еще прикреплен к линзе.

И визуально подтвердить, что объектив не имеет повреждений. Не позднее чем за два часа до начала измерения жесткости используйте аналитические весы, чтобы взвесить не менее 10 накладных крышек из одной и той же коробки. Определите средний вес чехлов чехла.

Затем предварительно намочите крышку стекла и прямоугольного зеркала при комнатной температуре PBS. Пока материалы гидратируются, заполните измерительную камеру от 65 до 75 миллилитров PBS. И поместите камеру под препарирующий микроскоп с 30-кратным увеличением, с подсветкой снизу и оптоволоконным источником света слева и справа.

Когда крышка будет готова, поместите зеркало под прямым углом в камеру на постоянном расстоянии от углубления, которое будет использоваться для удержания объектива. Далее с помощью изогнутых щипцов аккуратно перенесите рассеченные линзы в измерительную камеру. Установите оптическую мощность блока питания на 80% от максимальной интенсивности света и при необходимости отрегулируйте выходную мощность блока питания в зависимости от окружающего освещения, предпочтений пользователя и качества изображения.

Получение изображений незаряженных линз сверху непосредственно над камерой. Затем сделайте снимок края зеркала в фокусе, а затем сфотографируйте сбоку незаряженный объектив через зеркало за пределами углубления. Затем поместите линзу в углубление и убедитесь, что он надежно и точно установлен внутри углубления на его переднем или заднем полюсе.

Сделайте фото объектива в зеркале. Затем аккуратно наденьте на объектив крышку. Через две минуты сделайте еще одно изображение загруженного объектива сбоку.

Продолжайте добавлять покровные листы, получая изображения вида сбоку через две минуты после добавления каждого покровного листа, пока не будет применено в общей сложности 10 покровных накладок. Затем снимите все защитные стекла, подождите последние две минуты и получите изображения объектива сбоку внутри и снаружи углубления. И изображение объектива с видом сверху за пределами углубления.

Чтобы определить размер ядра хрусталика, поместите линзу в чистую чашку Петри, наполненную PBS, и с помощью тонких прямых щипцов аккуратно декапсулируйте хрусталик. Чтобы снять корковые волокна с клеток, покатайте хрусталик между пальцами в перчатках. Затем аккуратно промойте ядро линзы в PBS и поместите ядро обратно в измерительную камеру.

Получите изображение ядра хрусталика через зеркало под прямым углом. Наконец, для анализа изображений используйте соответствующее программное обеспечение для анализа изображений, чтобы измерить экваториальный и осевой диаметры линз до и после каждого этапа загрузки. Также измерьте диаметр ядра каждой линзы.

В этом репрезентативном эксперименте измеряли жесткость и размеры двух-, четырех- и восьмимесячных линз мышей, а также рассчитывали осевую и экваториальную деформации. Осевая деформация является логарифмической функцией приложенной нагрузки со статистически значимым, зависящим от возраста уменьшением осевой и экваториальной деформаций при максимальной приложенной нагрузке, что указывает на то, что хрусталик мыши с возрастом становится жестким. Данные изображений, собранные во время этого эксперимента, также были использованы для определения нескольких других морфологических характеристик хрусталика.

Как и ожидалось, осевой и экваториальный диаметры, а также объем линзы с возрастом увеличивались. Соотношение сторон указывает на то, что объектив имеет немного больший экваториальный диаметр, чем осевой. И этот параметр не менялся с возрастом.

Диаметр, объем и доля ядра хрусталика увеличиваются с возрастом, что позволяет предположить, что ядро хрусталика ремоделируется, увеличиваясь в относительном размере по мере старения хрусталика. После освоения этой техники она может быть выполнена за 30-45 минут на объектив, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно равномерно расположить линзу внутри углубления и позволить линзе расслабиться в течение двух минут между каждым дополнительным скольжением крышки.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить жесткость на сжатие и морфометрию линз мыши с помощью последовательного нанесения покровных стекол. Этот точный, простой и недорогой метод открывает исследователям линз путь к изучению биомеханических эффектов генных мутаций у мышей.