Высокая Анализ Содержание скрининг для оценки токсикологических эффектов вредных и потенциально вредных компонентов (HPHC)

Общая цель этого подхода, который сочетает в себе клеточный анализатор реального времени на основе импеданса и платформу на основе скрининга высокого содержания, заключается в предоставлении информации об эффективных дозах, токсичности и биологических эффектах для получения профиля токса тестируемых соединений. Такой подход может помочь ответить на ключевой вопрос в области токсикологии. Рассматривая, например, цитотоксичность, генотоксичность и клеточные реакции на стресс.

Более того, он не только предоставляет информацию о нескольких биохимических и морфологических параметрах одновременно, но и может быть применен к различным типам клеток и моделям клеточных культур. Из-за юрисдикции и ограничений, весь подход будет выполняться при оценке только небольшого участка соединения. По той же причине будет показан только один протокол для демонстрации оценки скрининга с высоким содержанием.

Демонстрировать процедуру будут Стефано Акали и Александр Лоран, техники из моей лаборатории. Чтобы увидеть нормальные эпителиальные клетки бронхов человека, или клетки NHBE, запрограммируйте прибор на определение количества и продолжительности измерений импеданса. В этом исследовании данные записываются каждые 15 минут, в течение 48 часов.

Измерьте фон планшета, пипетируя 50 микролитров предварительно подогретой среды в каждую лунку 96-луночного планшета RTCA. Этот шаг представляет собой техническое требование к прибору для расчета электрического сопротивления среды, которое будет использоваться в качестве базового эталона для расчетов на основе ячеек. Далее добавьте 50 микролитров клеточной суспензии в концентрации 144 000 клеток на миллилитр в среду уже в каждой лунке пластины RTCA.

После того, как клетка нагрелась, очень важно оставить пластину при комнатной температуре на 40 минут, чтобы клетки могли прикрепиться и получить равномерное распределение клеток. Инкубируйте планшеты RTCA в подставке в инкубаторе и начните записывать данные в течение следующих 24 плюс-минус двух часов до дозирования. Для положительного контроля разведите 10 миллимолярный стоковый раствор ставроспорина, один к 10, в ДМСО.

Добавьте пять микролитров разбавления к 195 микролитрам среды для получения 5-кратного рабочего раствора. Что касается вредных и потенциально вредных компонентов, растворите каждый из них в автомобиле, чтобы получить одномолярный раствор. Затем разбавьте каждый исходный раствор испытуемого вещества, от одного до 10, в среде для получения 100 миллимолярного раствора.

Сгенерируйте составную эталонную пластину путем добавления среды плюс 10% в скважинах от B до F и 100 миллимолярного раствора в скважине A. Выполните пятиступенчатое последовательное разведение от одного до 10 для получения 5x рабочих растворов. Для дозирования приостановите работу прибора RTCA, откройте подставку, чтобы снять экспопластину, и поместите пластину в температурный прибор RTCA, чтобы избежать охлаждения элементов, которое может повлиять на измерение импеданса. Добавьте 25 микролитров 5-кратного раствора с мастер-пластины Compound в ячейки в трех экземплярах, сохраняя тот же порядок дозирования, что и на мастер-пластине Compound.

Не удаляйте существующую среду для культивирования клеток. Затем добавьте 25 микролитров 5-кратного положительного контрольного раствора в клетки в правой половине нижнего ряда, не удаляя существующую питательную среду. Аналогично добавьте 25 микролитров среды в ячейки в левой половине нижнего ряда.

После запечатывания пластины с помощью запайщика пластин поместите пластину обратно в подставку RTCA и заблокируйте ее. Перезапустите запись данных для желаемого времени экспозиции. После записи данных проанализируйте данные о жизнеспособности клеток RTCA, чтобы определить, какое исследуемое вещество следует использовать в анализе HCS.

В этом эксперименте для анализа HCS были выбраны 1-аминонафтален, мышьяк, хром и кротональдегид. Чтобы увидеть клетки NHBE, добавьте 100 микролитров клеточной суспензии в концентрации 120 000 клеток на миллилитр в каждую лунку 96-луночной черной пластины. После выхода из чашки HCS при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы позволить клеткам прикрепиться к лункам, инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 24 плюс-минус двух часов перед дозированием.

Для положительного контроля дозируйте по 40 микролитров исходного раствора каждого положительного контроля во второй колонке. Затем раздайте по 20 микролитров транспортного средства в третьей и пятой колонках. И 40 микролитров транспортного средства в четвертой колонке.

Извлеките 12 микролитров из лунок во второй колонке, раздайте их в лунки в третьей колонке и перемешайте. Продолжайте до тех пор, пока не будет получено окончательное серийное разведение тремя дозами и носителем для каждого положительного контрольного соединения. Для получения положительной контрольной пластины готовят разведение от одного к 40 в среде трех доз и транспортного средства.

Чтобы сделать составную эталонную пластину, повторно суспензируйте и разбавьте каждое испытуемое вещество исходным раствором от одного до 10 в среде до концентрации 100 миллимоляров. Проводите разведение с использованием среды с 10%-ным носителем для получения выбранных 5-кратных доз для каждого испытуемого вещества. Как положительные элементы управления, так и составная пластина теперь готовы к дозированию на экспонционную пластину.

Затем добавьте 25 микролитров 5x растворов с мастер-пластины Compound в ячейки в трех экземплярах, сохраняя тот же порядок дозирования, что и на мастер-пластине Compound. Не удаляйте существующую среду для культивирования клеток. Затем добавьте 25 микролитров 5-кратного раствора из положительной контрольной пластины в ячейки в нижнем ряду, поддерживая тот же порядок дозирования, что и в положительной контрольной пластине.

Приготовьте достаточный объем раствора для окрашивания живых клеток, как описано в текстовом протоколе. Затем разбавьте краситель для митохондрий и краситель для проницаемости мембран в растворе для окрашивания живых клеток, в соответствии с инструкциями поставщика. Добавьте 50 микролитров раствора для окрашивания живых клеток в каждую лунку планшета, обозначенного как «Анализ цитотоксичности».

Не удаляйте среду для клеточных культур и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, 5% CO2. Осторожно отсасывайте среду и окрашивающий раствор и добавьте по 100 микролитров фиксирующего раствора в каждую лунку. Затем, выдержите тарелку в течение 20 минут при комнатной температуре, в темноте.

После инкубации аккуратно отасуньте фиксирующий раствор и промойте один раз 100 микролитрами буфера для промывки. Снимите промывочный буфер и добавьте 100 микролитров на лунку 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку перед инкубацией в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Отсадите буфер для пермеабилизации и дважды промойте планшет 100 микролитрами буфера для промывки на лунку.

Затем аспирируйте буфер для промывки и добавьте 100 микролитров 1x Блокирующего буфера в каждую лунку. Затем выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре, в темноте. Разведите антитело против цитохрома С в соотношении один к 250 в растворе первичного антитела.

Затем аспирируйте блокирующий буфер и добавьте 50 микролитров раствора первичного антитела в каждую лунку перед инкубацией в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте. Разведите антитело против мыши, от одного до 500, во вторичном антителе и ядерном растворе. Кроме того, разбавьте ядерный краситель в соотношении один к 1000 во вторичном антителе и ядерном растворе.

После откачки первичного раствора антитела промойте планшет три раза 100 микролитрами буфера для промывки на лунку, используя промывочную машину. Отсадите промывочный буфер и добавьте 50 микролитров вторичного антитела и ядерного раствора в каждую лунку планшета. Теперь выдержите тарелку в течение 60 минут при комнатной температуре, в темноте.

После аспирации вторичного антитела и ядерного раствора промойте планшет три раза 100 микролитрами буфера для промывки на лунку с помощью промывочной машины. Затем добавьте 100 микролитров буфера для промывки на лунку. Теперь пластина готова к оценке на приборе HCS, и начинается процесс приобретения.

Приведены репрезентативные результаты жизнеспособности клеток RTCA при обработке исследуемым веществом. Токсический дозозависимый эффект достигается в течение 24 часов воздействия только при использовании 1-аминонафталена, мышьяка, хрома и кротональдегида, так как все они показали расчетную ЛД50 менее 20 миллимоляров. С другими соединениями токсический эффект не наблюдался.

Здесь представлены репрезентативные результаты HCS только для лечения 1-аминонафталеном. Токсическое действие 1-аминонафталена вызывает серьезное повреждение клеточной мембраны, что приводит к увеличению проницаемости клеточной мембраны дозозависимым образом после четырех часов воздействия. Соединение также влияет на митохондрии, вызывая увеличение массы после четырех часов воздействия, а также высвобождение цитохрома С, который затем обнаруживается в ядрах после четырех и 24 часов воздействия.

После освоения эта техника может быть выполнена в течение двух-трех дней, так как большинство из них требуют около часа в день практического времени для настройки и дозирования. В зависимости от выбранного протокола, скрининг с высоким содержанием требует максимум трех с половиной часов для выполнения всей процедуры окрашивания. При попытке выполнить эту процедуру имейте в виду, что, хотя выбор более широкого диапазона конечных точек усложняет рабочий процесс, это не приведет к существенному увеличению времени.

При оптимальном рабочем процессе, по сути, несколько пластин могут оцениваться параллельно. Продолжающееся развитие High Content Screening Platform, включая полностью автоматизированную настройку клеток, разведение соединений, дозирование и окрашивание, а также добавление новых конечных точек, еще больше расширит возможности High Content Screening Platform как мощного инструмента для токсикологического профилирования. Более того, сочетание нескольких отдельных токсикологических точек с такой высокой пропускной способностью позволит нам сделать еще один шаг вперед в наших усилиях по сокращению химических испытаний на животных.