Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за противораковым терапевтическим ответом в отдельных клетках в культуре. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, включая гетерогенный терапевтический ответ и судьбу клеток. Для начала в сертифицированном стерильном ламинарном колпаке подготовьте клетки HT1080 в сертифицированных для культивирования чашках в соответствии с текстовым протоколом и инкубируйте клетки в инкубаторе для увлажненных клеточных культур.

За два дня до визуализации нанесите 50 000 клеток HT1080 FuGENE на лунку в желаемое количество лунок 12-луночной чашки со стеклянным дном No 1,5. Отрегулируйте количество пластинчатых клеток в зависимости от скорости их роста и используемой чашки, чтобы достичь примерно 60% слияния к началу эксперимента.

Установите в камере влажности около 80% и температуру в месте расположения образца на уровне 37 градусов Цельсия. Убедитесь, что резервуар для воды наполнен стерильной дистиллированной водой в соответствии с инструкциями производителя. Затем включите климатическую камеру на нужную температуру, установите ее в предметный столик микроскопа и установите.

Если между верхней камерой сцены и вставкой сцены есть свободное пространство, положите куски парафиновой пленки по краям отверстия для вставки на сцену, прежде чем вставлять в него камеру, чтобы соединить камеру со сценой. Убедитесь, что в камере не натягиваются соединения, которые могут привести к возникновению артефактов движения. Вставьте в камеру фиктивную чашку с водой и дайте камере уравновеситься до 37 градусов по Цельсию, а затем поддерживайте стабильную температуру.

Чтобы настроить визуализацию, включите микроскоп, компьютер и все необходимые периферийные устройства. В зависимости от источника света подождите, пока он не понадобится. Когда револьверная головка объектива находится в низком положении, выберите объектив с числовой апертурой 20x 0,7.

Затем поместите образец над объективом, что облегчит поиск клеток, когда образец находится в камере. После переноса визуализируемых ячеек в климатическую камеру, согласно текстовому протоколу, запечатайте камеру для поддержания стабильной среды и включите атмосферный газ. Затем выберите условия изображения, которые предотвратят фототоксичность за счет ограничения времени экспозиции и использования света более низкой интенсивности.

Найти плоскости X, Y и Z и требуемые длины волн для каждой позиции, которую необходимо изобразить. Для долгосрочного промежутка времени большинства клеточных процессов получайте одно изображение каждые десять-двадцать минут. Более высокое временное разрешение обеспечивает большее количество точек данных и более надежное отслеживание клеток, но приводит к более интегрированному воздействию света и большим наборам данных.

Поскольку HT1080 FuGENE имеет динамические зеленые и красные флороресцентные белки, используйте следующее время воздействия и используйте контейнер два на два. В разделе «Расширенные настройки» включите программно-управляемую автофокусировку с использованием настроек по умолчанию. Определите диапазон автофокусировки 10 микрометров с рекомендуемым размером шага.

В экспериментальной чашке для уменьшения теплового дрейфа замените половину среды на среду, содержащую нужный препарат, которая была нагрета до 37 градусов Цельсия. Наконец, запустите таймлапс и получите изображения в соответствии с текстовым протоколом. В этих фильмах показаны примеры пары совместимых клеточных линий MCF7, полученных из рака молочной железы, которые отличаются только своим статусом p53, которые были обработаны противораковым препаратом, ингибирующим кинезин-5, что приводит к остановке митоза.

Как видно на этом рисунке, когда р53 удаляется путем стабильного нокдауна р53, вместо того, чтобы останавливаться после того, как они покидают митоз, клетки проходят через повторяющиеся циклы, в которых они вступают во второй раунд митоза, а не останавливаются, и покидают митоз без деления. Здесь показаны клетки Hela, полученные из карциномы шейки матки, стабильно экспрессирующие маркер хроматина Histone 2b, слитый с mCherry, и бета-тубулин, слитый с EGFP. При лечении препаратом, стабилизирующим микротрубочки, паклитаксолом, выравнивание хромосом и сегрегация нарушаются во время митоза, что приводит к образованию ядерных выпуклостей и микроядер, склонных к повреждению ДНК.

Эта клеточная линия стабильно коэкспрессирует два индикатора флороресцентного убиквитина клеточного цикла для CDT1, оранжевого цвета и геминина зеленого цвета, и нормально прогрессирует по клеточному циклу. Когда те же клетки обрабатываются ингибитором CDK46, клетки проходят через фазу G2 и делятся нормально, а затем сильно останавливаются в фазе G1, что указывает на потенциал аффективных цитостатических эффектов при растущих опухолях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете отслеживать реакцию одной клетки непосредственно в режиме реального времени в течение многих дней, а не делать выводы об этих реакциях.