Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака
14 мая 2016 г.
Здесь мы описываем метод долгосрочной покадровой микроскопии для продольного отслеживания отдельных клеток в ответ на противораковую терапию.
Общая цель данной процедуры заключается в наблюдении за противоопухолевым терапевтическим ответом отдельных клеток в культуре. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, включая гетерогенность терапевтического ответа и судьбу клеток. Для начала в сертифицированном стерильном ламинарном шкафу подготовьте культуру клеток HT1080 в чашках, сертифицированных для культивирования, согласно текстовому протоколу, и инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе для культур клеток.
За два дня до визуализации посейте по 50 000 клеток HT1080 FuGENE в каждое из необходимого количества лунок 12-луночного планшета со стеклянным дном (№ 1,5). Отрегулируйте количество высеваемых клеток в зависимости от скорости их роста и используемого планшета, чтобы к началу эксперимента достичь примерно 60% конфлюэнтности.
Настройте климатическую камеру так, чтобы влажность составляла примерно 80%, а температура в месте размещения образца была установлена на 37 °C. Убедитесь, что резервуар для воды заполнен стерильной дистиллированной водой в соответствии с инструкциями производителя. Затем включите климатическую камеру, установив желаемую температуру, поместите ее на предметный столик микроскопа и зафиксируйте.
Если между верхней камерой предметного столика и вставкой столика имеется свободное пространство, перед установкой камеры наложите кусочки парафиновой пленки на края отверстия вставки столика, чтобы зафиксировать камеру на столике. Убедитесь, что никакие соединения не создают натяжения камеры, так как это может привести к возникновению артефактов движения. Поместите в камеру контрольный планшет с водой и дайте камере прогреться до 37 °C, после чего поддерживайте стабильную температуру.
Для подготовки к визуализации включите микроскоп, компьютер и все необходимые периферийные устройства. В зависимости от типа источника света, включите его непосредственно перед началом работы. Установив турель объективов в нижнее положение, выберите объектив 20x с числовой апертурой 0.7.
Затем расположите образец над объективом; это облегчит поиск клеток после помещения образца в камеру. Перенесите клетки, предназначенные для визуализации, в климатическую камеру согласно текстовому протоколу, герметично закройте камеру для поддержания стабильных условий и включите подачу атмосферного газа. Далее выберите условия визуализации, которые позволят предотвратить фототоксичность за счет ограничения времени экспозиции и использования света меньшей интенсивности.
Определите плоскости X, Y и Z, а также необходимые длины волн для каждой позиции, подлежащей визуализации. Для длительного тайм-лапс наблюдения за большинством клеточных процессов делайте один снимок каждые десять-двадцать минут. Более высокое временное разрешение обеспечивает большее количество точек данных и более надежное отслеживание клеток, но приводит к увеличению суммарной экспозиции света и большему объему наборов данных.
Поскольку клетки HT1080 FuGENE содержат динамические зеленые и красные флуоресцентные белки, используйте следующие времена экспозиции и режим биннинга 2x2. В расширенных настройках включите программную автофокусировку, используя параметры по умолчанию. Установите диапазон автофокусировки 10 micrometers с рекомендуемым размером шага.
В экспериментальной чашке, чтобы уменьшить тепловой дрейф, замените половину среды средой, содержащей необходимый препарат, предварительно нагретой до 37 °C. В завершение запустите таймлапс и получите изображения согласно текстовому протоколу. В данных видео представлены примеры пары сопоставимых линий клеток MCF7, производных от рака молочной железы, которые различаются только статусом p53; клетки были обработаны противоопухолевым препаратом, который ингибирует кинезин-5, что приводит к митотическому аресту.
Как видно на этом рисунке, при удалении p53 путем стабильного нокдауна p53, вместо остановки после выхода из митоза, клетки проходят через повторяющиеся циклы, в которых они вступают во второй раунд митоза вместо остановки и выходят из митоза без деления. Здесь показаны клетки HeLa, производные от карциномы шейки матки, стабильно экспрессирующие маркер хроматина Histone 2b, слитый с mCherry, и бета-тубулин, слитый с EGFP. При воздействии стабилизирующего микротрубочки препарата паклитаксела выравнивание и сегрегация хромосом во время митоза нарушаются, что приводит к образованию ядерных выпячиваний и микроядер, которые склонны к повреждению ДНК.
Данная клеточная линия стабильно коэкспрессирует два флуоресцентных убиквитин-индикатора клеточного цикла для CDT1 (оранжевый цвет) и геминина (зеленый цвет), при этом клетки проходят через клеточный цикл нормально. При воздействии на эти же клетки ингибитора CDK46 они проходят через фазу G2 и нормально делятся, после чего происходит выраженный арест в фазе G1, что указывает на возможность эффективного цитостатического воздействия на растущие опухоли. Основным преимуществом данного метода является возможность напрямую наблюдать за ответом отдельной клетки в режиме реального времени на протяжении многих дней, а не делать косвенные выводы об этих реакциях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод длительной таймлапс-микроскопии для отслеживания реакций отдельных клеток на противоопухолевые препараты. Этот метод позволяет исследователям в режиме реального времени наблюдать за гетерогенным терапевтическим ответом и судьбой клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические основы
- Понимание клеточных ответов на противоопухолевые препараты имеет решающее значение для лечения рака.
- Анализ единичных клеток позволяет получить представление о клеточной гетерогенности.
- Таймлапс-микроскопия позволяет наблюдать за динамическими клеточными процессами.
- Линии клеток HT1080 и HeLa широко используются в исследованиях рака.
Цель исследования
- Для наблюдения за воздействием противоопухолевых препаратов на отдельные клетки.
- Для изучения механизмов, лежащих в основе различных терапевтических ответов.
- Для обеспечения метода долгосрочной визуализации поведения клеток.
Используемые методы
- Подготовка клеток HT1080 в культуральных чашках.
- Настройка климатической камеры для обеспечения стабильных условий визуализации.
- Использование таймлапс-микроскопии для регистрации клеточных ответов в динамике.
- Применение флуоресцентных маркеров для визуализации клеточных процессов.
Основные результаты
- Клетки с нокдауном p53 демонстрировали аномальное поведение при митозе.
- Обработка паклитакселом нарушала выравнивание хромосом в клетках HeLa.
- Обработка ингибитором CDK46 показала потенциальный цитостатический эффект.
- Отслеживание в режиме реального времени позволило изучить ответы на уровне отдельных клеток.
Выводы
- Данный метод позволяет детально наблюдать за реакциями отдельных клеток на воздействие препаратов.
- Визуализация в режиме реального времени может дать важные сведения о поведении раковых клеток.
- Этот подход расширяет понимание терапевтической эффективности и механизмов резистентности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Продольное отслеживание отдельных клеток восполняет критический пробел в разработке онкологических препаратов, выявляя гетерогенные терапевтические ответы, которые маскируются при использовании популяционных анализов. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и идентификации ведущих соединений, позволяя напрямую наблюдать за принятием клетками решений о своей судьбе, динамикой сигнальных путей и механизмами резистентности в течение длительных периодов времени. Данный метод способствует механистическому снижению рисков и обеспечению трансляционной непрерывности от этапа поиска до доклинических стадий, что позволяет оптимизировать распределение ресурсов в портфеле препаратов и принимать обоснованные решения о продвижении кандидатов с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямого наблюдения гетерогенных ответов на противоопухолевые соединения в изогенных клеточных моделях.
- Практическая ценность: позволяет выявить специфические эффекты сигнальных путей, такие как остановка митоза, остановка в фазе G1 или индукция повреждения ДНК, с помощью показаний биосенсоров в режиме реального времени.
- Трансляционная ценность: способствует подбору биомаркеров путем установления связи между динамикой флуоресцентных репортеров (например, клеточного цикла, апоптоза) и функциональными результатами.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных временных рядов о пролиферации, прохождении клеточного цикла и субклеточной локализации для скрининга соединений.
- Воспроизводимость: стабилизация в климатической камере минимизирует дрейф и появление артефактов, что позволяет проводить согласованные лонгитюдные измерения в разных повторностях.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными форматами и автоматизированным контролем фокуса обеспечивает поддержку кампаний по фенотипическому скринингу со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирование контекста рака человека с использованием линий HT1080 (фибросаркома) и HeLa (карцинома шейки матки) с определенными генетическими пертурбациями.
- Снижение механистических рисков: Разграничение цитостатических и цитотоксических эффектов, а также выявление аберрантного повторного вступления в клеточный цикл как механизма резистентности.
- Преклиническая преемственность: Обеспечение связи между фенотипами взаимодействия с мишенью и функциональными исходами судьбы клеток в физиологически значимых временных рамках.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации лида, при которой динамические фенотипические показатели позволяют определять зависимости «структура — активность» и профили селективности.
- Биология открытий: Проверка гипотез относительно мишеней путем установления связи между воздействием препарата и изменениями пролиферации, динамики хромосом и апоптотических сигналов в режиме реального времени.
- Скрининг: Получение высокосодержательных данных с временным разрешением, подходящих для оценки влияния соединений на гетерогенные популяции клеток.
- Аналитика: Возможность извлечения кинетических параметров (например, продолжительности ареста, частоты повторного входа в цикл), которые позволяют проводить сравнительный ранжинг соединений.
- Трансляционные исследования: Связывание фенотипов in vitro с клиническими биомаркерами ответа и резистентности с помощью специфических для конкретных путей репортеров.
- Корпоративное повторное использование: Создание многоразовой платформы визуализации, применимой для различных онкологических показаний и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет выявления транзиторных, редких или отсроченных ответов, которые невозможно обнаружить с помощью конечных методов анализа.
- Операционная ценность: Стандартизирует долгосрочную визуализацию живых клеток в контролируемых условиях, повышая согласованность данных между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), позволяя на ранних этапах выявить такие механизмы ответственности, как митотическая катастрофа (mitotic slippage) или адаптивная резистентность.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию соединений на основе оценки рисков, опираясь на профили ответа единичных клеток и устойчивость эффекта.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток, контроля условий окружающей среды и валидации флуоресцентных биосенсоров.
- Зависимость от систем инкубации на предметном столике, оборудования для коррекции дрейфа и высокочувствительных камер.
- Необходимы стандартизированные операционные процедуры для уравновешивания камеры, замены среды и поддержания фокуса.
- При адаптации метода следует учитывать управление фототоксичностью, спектральное перекрытие биосенсоров и плотность посева конкретных клеточных линий.
- Практические ограничения включают требования к хранению данных и сложность анализа при долгосрочном многопараметрическом отслеживании.
