Многоцветная флуоресценция обнаружения для дроплета Microfluidics Использование оптических волокон

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать простое применение микрофлюоресцентного детектирования капель с помощью оптических волокон. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы высокопроизводительного биологического скрининга, такие как идентификация редких фенотипов и направленная эволюция ферментов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет легко и недорого применять флуоресцентное детектирование в капельной микрофлюидике.

Для начала поместите предварительно очищенную кремниевую пластину диаметром три дюйма на вакуумный патрон установки для нанесения покрытий. Затем нанесите один миллилитр SU-8 3050 в центр пластины и вращайте пластину, чтобы получить слой фоторезиста толщиной 80 микрометров. Снимите пластину с покрытием с отверткой и поместите ее на горячую плиту, нагретую до 135 градусов Цельсия.

Через 30 минут выньте пластину и дайте ей остыть до комнатной температуры. Затем поместите пластину на плоскую поверхность и выровняйте маску первого слоя по пластине. Подставьте пластину под коллимированный светодиод мощностью 190 милливатт и яркостью 365 нанометров в течение трех минут.

После экспонирования поместите пластину на конфорку с температурой 135 градусов Цельсия на одну минуту, а затем дайте ей остыть до комнатной температуры. Когда клетка остынет, поместите ее обратно на прядильную машину и прикрепите ее к патрону. Нанесите дополнительный миллилитр SU-8 3050 в центр пластины и вращайте в течение 20 секунд со скоростью 500 об/мин.

затем 30 секунд при 5 000 оборотов в минуту. Далее выпекаем на конфорке. Дайте ему остыть до комнатной температуры, а затем поместите обратно на поверхность выравнивания маски.

С помощью области препарирования вручную выровняйте маску второго слоя по шаблонным меткам выравнивания на пластине. После правильного выравнивания экспонируйте пластину с покрытием на 4-1/2 минуты, используя те же условия, что и раньше. После экспонирования поместите пластину на горячую плиту при температуре 135 градусов Цельсия на одну минуту, затем охладите пластину и прикрепите ее обратно к отжимной машине.

Нанесите один миллилитр SU-8 3050 на пластину в третий раз и вращайте, чтобы добавить дополнительные 100 микрометров фоторезиста. Выньте и выпекайте на конфорке при температуре 135 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем охладите его до комнатной температуры и поместите на выравнивающую поверхность.

Совместите маску третьего слоя с предыдущей геометрией и экспонируйте покрытую пластину в предыдущих условиях в течение девяти минут. После экспонирования поместите пластину на конфорку с температурой 135 градусов Цельсия на одну минуту, а затем охладите ее до комнатной температуры. Как только маска остынет, проявите ее, погрузив в размешанную ванночку с проявителем на 30 минут.

Наконец, промойте в изопропаноле, а затем выпекайте ее в последний раз в течение одной минуты на конфорке при температуре 135 градусов Цельсия. Храните разработанный мастер в 100-миллиметровой чашке Петри до формовки. Приготовьте смесь PDMS в соотношении 10:1, смешав 50 граммов силиконовой основы с пятью граммами отвердителя в пластиковом стаканчике.

Смешайте содержимое с помощью вращающегося инструмента, а затем дегазируйте смесь внутри эксикатора в течение 30 минут или до тех пор, пока не будут удалены все пузырьки воздуха. Залейте дегазированный PDMS над подготовленным мастером до получения толщины в три миллиметра. Затем поместите чашку Петри обратно в эксикатор для дальнейшей дегазации.

Как только все пузырьки будут удалены, выпекайте прибор при температуре 80 градусов Цельсия в течение 80 минут. После охлаждения вырежьте устройство из формы с помощью скальпеля так, чтобы телегеометрия 120 микрометров и телегеометрия 220 микрометров были доступны со стороны устройства. Затем пробейте входные и выходные отверстия жидкости биопсийным пуансоном 0,75 мм.

Плазменная обработка устройства функциональной стороной вверх вместе с предварительно очищенным стеклянным стеклом и кислородной плазмой 1 миллибар в течение 20 секунд в плазменном очистителе мощностью 300 Вт. Приклейте устройство, плотно поместив узорчатую сторону устройства PDMS на обработанную плазмой сторону предметного стекла. Затем поместите устройство в духовку с температурой 80 градусов Цельсия и верните собранное устройство на 40 минут.

После запекания с помощью шприца промойте устройство фторированной жидкостью для обработки поверхности, чтобы сделать каналы гидрофобными. Затем сразу же запекайте прибор при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы растворитель испарился. Подготовьте два волокна лазерного возбуждения, сняв изоляцию с последних пяти миллиметров оптических волокон.

Кроме того, подготовьте волокно для сбора флуоресцентного сигнала, сняв изоляцию с последних пяти миллиметров большего оптического волокна. Осмотрите кончики всех волокон под микроскопом. Если кончики не заканчиваются ровной поверхностью, зафиксируйте концы волокнистым накладкой.

Затем прикрепите соединитель лазерного волокна к лазеру мощностью 50 милливатт и 405 нанометров и прикрепите к лазеру одно из волокон сердцевины 105 микрометров. Направьте зачищенный конец датчика измерителя мощности лазера и используйте точную регулировку лазерного соединителя для максимизации мощности лазера. Выполните тот же процесс для настройки другого волокна с помощью лазера мощностью 50 милливатт и длиной 473 нанометра.

Затем установите четырехполосовой фильтр на фотоумножитель с помощью линзовых трубок, блокирующих лазерный свет и пропускающих излучаемую флуоресценцию. Прикрепите оптоволоконную муфту так, чтобы свет проходил через фильтры до попадания на фотоумножитель. Далее присоедините собирающее волокно к муфте для волокна.

Поместите изготовленный микрофлюидный чип на предметное столико инвертированного микроскопа в сочетании с цифровой камерой, способной выдерживать выдержку не менее 100 микросекунд. Осторожно работая с боков, вставьте волокно, связанное с лазером 473 нанометра, в самый дальний восходящий канал 120 микрометров. Следите за тем, чтобы не проколоть основной канал потока.

Затем вставьте волокно, связанное с лазером 405 нм, в самый дальний боковой канал высотой 120 микрометров, обеспечивая расстояние между волокнами 300 микрометров. Наконец, вставьте более крупное волокно, связанное с фотоумножителем, в канал высотой 220 микром, перпендикулярный двум волокнам лазерного возбуждения. Наполните пятимиллилитровый шприц, наполненный HFE 7500, содержащим 2%-ное ионное фторповерхностно-активное вещество, и установите его на входное отверстие масляного распорки устройства обнаружения с помощью трубки PE2.

Затем наполните шприц смешанной эмульсией FITC и синим красителем и установите его на вертикально ориентированный шприцевой насос, соединенный с устройством в качестве входа для обратной инъекции капель с помощью трубки PE2. Подсоедините отрезок полиэтиленовой трубки от выхода устройства к контейнеру для отходов. Затем заправьте устройство, запустив каждый из насосов со скоростью 1000 микролитров в час до тех пор, пока не станет видно, что масло и капли регулярно соединяются в устройстве и стекают вниз по потоку.

Отрегулируйте скорость потока таким образом, чтобы масло со спейсером работало со скоростью 6 000 микролитров в час, а капли — со скоростью 100 микролитров в час, обеспечивая значительное расстояние между каплями, проходящими через зону обнаружения. Затем включите лазеры и запустите программу сбора данных. Затем отрегулируйте усиление фотоумножителя таким образом, чтобы сигналы более чем в 100 раз превышали базовый уровень шума.

Наконец, отрегулируйте мощность лазера так, чтобы все пики дублета были четко видны на одной линейно масштабируемой временной трассе. Капля, протекающая по каналу детектирования, сталкивается с дискретными областями возбуждения перед каждым из оптических волокон, связанных с лазером. Детектирующее волокно регистрирует излучаемую флуоресценцию с временным сдвигом с разделением пиков, которое коррелирует со временем, которое требуется капле для перемещения из одной области возбуждения в другую.

Это избавляет от необходимости дополнительной светофильтрации и отдельных фотоумножителей. Эффективность схемы детектирования была проверена путем детектирования смешанной эмульсии капель, содержащих красители, которые возбуждают на 405 нанометрах и на 473 нанометрах. На этом графике показано четкое разделение между четырьмя типами повторно вводимых капель при потоке с частотой примерно 50 Гц.

Динамический диапазон и абсолютная чувствительность детектора исследовали путем измерения только капель флуоресцеина. Данные показывают способность системы обнаруживать концентрации красителя в диапазоне от 0,1 до 100 наномоляров. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как реализовать простую и компактную систему обнаружения флуоресценции с использованием массива вставленных оптических волокон и одного фотодетектора.