Расширенная Покадровый прижизненной визуализации в режиме реального времени многоклеточных Динамика в опухоли микроокружения

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации динамических процессов в микроокружении опухоли с помощью intravital мультифотонной микроскопии высокого разрешения. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о микроокружении опухоли, например, о том, какие динамические события участвуют в обеспечении проницаемости сосудов и многоклеточных взаимодействиях. Основным преимуществом данной методики является возможность наблюдения и количественной оценки кинетики процессов в микроокружении опухоли.

Перед началом процедуры включите все компоненты микроскопа и лазера, включая двухфотонные лазеры и детекторы. Установите температуру термостата на 30 °C для предварительного нагрева предметного столика. Протрите предметный столик микроскопа и вставку для столика 70% этанолом.

Когда предметный столик станет сухим, нанесите большую каплю воды на микроскопный объектив 25 x 1.05 NA для обеспечения оптического контакта с покровным стеклом и поместите покровное стекло толщиной № 1.5 над портом визуализации вставки. Затем отрежьте кусок полиэтиленового трубки длиной 30 сантиметров. Поместите резиновую прокладку поверх покровного стекла.

С помощью пинцета отломите иглу калибра 31 G от пластикового крепления и вставьте тупой конец основания иглы в трубку. В другой конец полиэтиленовой (PE) трубки вставьте и закрепите иглу калибра 31 G. Затем наполните шприц объемом 1 cc стерильным PBS и присоедините шприц к игле калибра 31 G.

Используйте PBS, чтобы вытеснить весь воздух из трубки и иглы. Затем наполните один шприц объемом 1 cc 200 µL соответствующего васкулярного маркера, а другой — соответствующим инъекционным белком. Перед началом операции убедитесь в достаточности анестезии по отсутствию реакции на сжатие пальца лапы и нанесите глазную мазь анестезированной мыши.

Затем поместите животное на хирургическую платформу под греющую лампу для усиления кровообращения в хвосте. Через две минуты простерилизуйте хвост 70% ethanol и введите кончик катетера 31 gauge на два-три миллиметра в латеральную хвостовую вену. Затем зафиксируйте катетер кусочком лабораторной ленты длиной один сантиметр, чтобы игла располагалась параллельно вене вдоль хвоста.

После фиксации катетера протрите вентральную поверхность и поверхность опухоли 70% ethanol. Затем приподнимите кожу в области живота и с помощью стерильных ножниц сделайте подкожный разрез длиной примерно один сантиметр вдоль вентральной срединной линии живота, стараясь не проколоть брюшину. Осторожно перережьте соединительную ткань, прикрепляющую молочную железу и опухоль к брюшине, чтобы обнажить опухоль.

Затем с помощью ножниц и пинцета аккуратно удалите фасцию и жировую ткань с обнаженной поверхности опухоли. После обнажения опухоли перенесите мышь на предварительно нагретый столик для визуализации. С помощью лабораторной ленты зафиксируйте покровное стекло, затем поместите опухоль в отверстие резиновой прокладки, закрывающей покровное стекло над объективом микроскопа.

Когда животное зафиксировано в нужном положении, заполните камеру с резиновой прокладкой раствором PBS, чтобы ткани оставались увлажненными и сохранялся оптический контакт с покровным стеклом. Поместите датчик-ошейник пульсоксиметра на шею для мониторинга жизненно важных показателей животного и установите над животным нагревательный бокс. Затем с помощью системы управления микроскопом сфокусируйтесь на флуоресцентных опухолевых клетках на поверхности опухоли и определите область с протекающими кровеносными сосудами.

После выбора интересующей области переведите микроскоп в режим многофотонной визуализации и с помощью регулятора фокусировки переместите объектив в желаемую начальную точку. Затем нажмите кнопку Z position top, чтобы установить верхний предел Z-стека, и визуализируйте сеть коллагеновых волокон на поверхности опухоли в канале генерации второй гармоники. После этого переместите объектив на требуемую глубину сканирования и нажмите кнопку z position bottom, чтобы установить нижний предел Z-стека.

Затем введите нужное значение в поля размера шага. После этого перейдите на панель Time Lapse и введите соответствующий интервал времени. После определения параметров визуализации замените шприц, подсоединенный к катетеру, на шприц с красителем для маркировки сосудов и медленно введите не более 200 µL раствора красителя, следя за тем, чтобы раствор попал в вену.

После инъекции снова подсоедините шприц с PBS к катетеру и начните Z-стековую интервальную съемку. Когда все изображения будут получены, замените шприц с PBS шприцем, содержащим инъекционный белок, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха в линию. Затем медленно введите суспензию белка мыши и снова замените шприц на шприц с PBS.

Макрофаги можно отслеживать с помощью флуоресцентно меченного декстрана массой 70 килДальтон, который накапливается в фагоцитирующих макрофагах. Двойное мечение опухолевых клеток и макрофагов позволяет визуализировать прямое взаимодействие этих двух типов клеток в режиме реального времени. Для визуализации изменений проницаемости сосудов опухоли для мечения сосудистого пространства также могут быть использованы квантовые точки.

Поскольку они достаточно велики, чтобы не диффундировать легко через межартериальные пространства. Непрерывная визуализация с высоким разрешением облегчает фиксацию событий сосудистой проницаемости и количественную оценку кинетики экстравазации и клиренса декстрана. В данном примере поля зрения пик сосудистой экстравазации наблюдается между 29 и 34 минутами, о чем свидетельствует экстраваскулярный сигнал TMR.

Инъекции дополнительных сосудистых красителей или белков для индукции сосудистой проницаемости позволяют получить представление о сигнальных событиях, регулирующих этот процесс. Действительно, в первые несколько секунд после инъекции можно наблюдать выход FITC-декстрана с молекулярной массой 10 kilodaltons из сосудистого русла, в то время как TMR-декстран с молекулярной массой 155 kilodalton остается ограниченным сосудистым пространством. При должном навыке выполнение этой техники занимает один час, если процедура проводится правильно.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости осторожного удаления соединительной ткани, чтобы не повредить поверхность опухоли, а также поддерживать ее увлажненную. После проведения данной процедуры анализа клеточной динамики можно визуализировать миграцию опухолевых клеток, что позволит ответить на дополнительные вопросы о направленности миграции клеток опухоли и интравазации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать динамические клеточные события в микроокружении опухоли с помощью интервитальной многофотонной микроскопии.