Стволовых клеток На основе Engineered иммунитет против ВИЧ-инфекции в модели Гуманизированные мыши

Общей целью данной процедуры является создание гуманизированной мыши, модифицированной химерным антигенным рецептором. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ и иммунологии в отношении проверки эффективности искусственного иммунитета на основе стволовых клеток против ВИЧ-инфекции и других хронических инфекций и злокачественных новообразований. Например, механизм иммунного отказа и способы усиления иммунной системы и разработки терапии для создания лучшего противовирусного или противоопухолевого иммунитета.

Главное преимущество данной методики заключается в том, что она способна на проведение большого количества экспериментальных манипуляций. Гуманизированная модель мышей BLT имитирует иммунитет человека и в этом случае позволяет проводить доклинические испытания клеточной генной терапии против ВИЧ-инфекции. Демонстрировать процедуру будут Валери Резек и Брианна Лам, они являются техниками из моей лаборатории.

Начните с того, что с помощью скальпелей разрежьте тимус на небольшие кусочки размером около одного миллиметра, нарезанные кубиками в чашке, содержащей добавленную среду RPMI. Затем с помощью изогнутых тупых щипцов каждый отдельный кусочек тимуса помещался в одну лунку на 96-луночной пластине. Добавьте 100-200 микролитров среды во все лунки, чтобы ткань не пересыхала.

Визуализируйте ткань под микроскопом, чтобы удалить любую ткань, которая может не быть тимусом или к которой прикреплена соединительная ткань. Затем удалите подтвержденные кусочки тимуса, объедините их в колбу для клеточной культуры Т25. Добавьте в колбу семь миллилитров среды RPMI, обогащенной антибиотиком, и осторожно перемешайте.

Затем поместите колбу в инкубатор для тканевых культур. Этот шаг предотвращает бактериальное загрязнение тканей. Начните выделение CD34-положительных ГСК из печени плода, используя два скальпеля, чтобы разрезать печень на небольшие кусочки размером около трех миллиметров, нарезанные кубиками в чашке, содержащей IMDM.

Удалите и выбросьте всю белую соединительную ткань. Затем с помощью шприца объемом 10 миллилитров, оснащенного тупой иглой 16-го калибра, удалите кусочки печени и среды и переложите их в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Аккуратно возьмите и выдвиньте еще пять-семь раз, чтобы полностью гомогенизировать ткань.

После приготовления 10 миллилитров среды IMDM дополните ее коллагеназой, гиалуронидазой, антибиотиками, дназой и противогрибковым средством. Пропустите фильтр через фильтр 0,22 микрона. Затем добавьте отфильтрованную среду в печеночную суспензию.

После закрытия конической трубки объемом 50 миллилитров, содержащей печеночную суспензию, плотно закройте ее самогерметизирующейся пленкой, такой как парапленка, чтобы предотвратить утечки. Вращайте в трубчатом вращателе в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут. После инкубации отфильтруйте переваренную клеточную суспензию через клеточный фильтр 100 микрон в свежую 50-миллилитровую пробирку.

Добавьте в суспензию PBS, чтобы довести общий объем до 50 миллилитров. Разделите его на две пробирки по 50 миллилитров, каждая из которых содержит 25 миллилитров клеточной суспензии. Замедлите и аккуратно подложите клетки в каждую пробирку 10 миллилитров центрифугирующей среды, такой как Ficoll.

Крутите со скоростью 1200 раз g в течение 20 минут без перерыва. После центрифугирования осторожно извлеките интерфейс из каждой пробирки и переложите его в две отдельные пробирки по 50 миллилитров. Доведите объем каждой трубки интерфейса до 50 миллилитров с PBS.

А затем центрифугировать при 300-кратном g в течение 7-10 минут. Соедините и промойте клеточные гранулы три раза с 50 миллилитрами PBS, содержащими два процента FBS, вращая при 300-кратном передозировке г в течение 7-10 минут каждый раз. После окончательного отжима повторно суспендируйте гранулу в 50 миллилитрах среды RPMI плюс 10 процентов FBS.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем немедленно отсортируйте CD34-положительные клетки с помощью набора для сортировки CD34 в соответствии с протоколом производителя и сохраните как CD34-положительную, так и CD34-отрицательную фракцию. Высыпаем кусочки тимуса и медиум из колбы в 60-миллиметровую посуду.

Охладите наконечники пипеток с положительным смещением, поместив их в открытые 1,5-миллилитровые стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой на льду. Также поместите на лед клеточные гранулы и объем студенистой белковой смеси, такой как матригель. Обезболите мышей-реципиентов инъекционным анестетиком в соответствии с утвержденным протоколом для животных.

Проверьте уровень анестезии мыши, сдавливая лапу. Отсутствие реакции на щипки свидетельствует о хирургической плоскости анестезии. Выбрейте левую сторону каждой мыши от бедра до плеча между центром спины и животом.

Подкожно вводите шесть миллиграммов на килограмм разведенного Карпрофена в плечо или паховый треугольник животного. Промойте канюлю троакара с PBS в 60-миллиметровой посуде. С помощью пары тупых изогнутых щипцов поместите кусочек тимуса из 60-миллиметровой чашки прямо в отверстие канюли, затем потяните назад за троакар, чтобы аспирировать ткань в канюлю.

Затем с помощью пипетки прямого вытеснения и охлажденного наконечника добавьте пять микролитров холодной смеси желатинового белка в пробирку с клеточной гранулой. И аккуратно перемешайте, чтобы образовалась клеточная суспензия. Пипеткой введите клеточную суспензию в отверстие канюли и медленно потяните назад на троакар, чтобы загрузить иглу.

Промокните выбритый участок мыши повидон-йодом с последующим нанесением изопропенила три раза. Определите самое темное пятно под кожей, которое указывает на расположение селезенки. Почка находится примерно в пяти миллиметрах дорсально от селезенки.

После обеспечения подходящего уровня анестезии за счет отсутствия реакции на защемление лапы, используйте изогнутые щипцы для подтяжки кожи и с помощью хирургических ножниц сделайте 15-миллиметровый разрез на коже параллельно селезенке. Затем сделайте аналогичный надрез в нижнем слое брюшины. У самцов почка хорошо заметна, поэтому выдавливается просто при надавливании на живот.

Поддержите почку с помощью кровоостанавливающего средства или пары изогнутых тупых щипцов. У женщин яичники, как правило, блокируют почку от легкого извлечения. С помощью гемостата подхватить яичник и аккуратно обнажить почку.

С помощью щипцов с игольчатым наконечником проделайте крошечное отверстие на заднем конце капсулы почки. Вставьте троакар в это отверстие и вдоль почки до тех пор, пока отверстие канюли не будет полностью закрыто капсулой почки. Аккуратно выдавите ткань под капсулой почки и вытяните троакар обратно.

Используйте изогнутые щипцы, чтобы убедиться, что кусочек тимуса не выходит обратно вместе с иглой. Затем поднимите брюшину вверх с помощью щипцов и аккуратно с помощью гемостата верните почку на место. Завяжите один двойной узелковый стежок хирургическим швом в области брюшины.

Также поместите два зажима Autoclips Wound, чтобы закрыть кожу. Теперь смешайте трансдуцированные CD34-положительные клетки и аспирируйте в 0,5 раза по 10 до шести клеток объемом 100 микролитров в инсулиновый шприц. Введите эти клетки мышке с помощью инъекции в ретроорбитальную вену.

После инъекции нанесите небольшую каплю глазной смазки на каждый глаз и положите мышь на бок обратно в клетку. После имплантации всех мышей подтвердите, что животные восстановили добросовестность и передвигаются, прежде чем возвращать их в помещение для проживания. Мышей приносили в жертву через 10 недель после операции, а кровь, селезенку, тимус и костный мозг собирали.

Полученные клетки окрашивали антителами против человеческого CD45 и античеловеческого CD4 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Как видно на рисунке, модифицированные химерными антигенными рецепторами CD4 клетки могут быть обнаружены в нескольких лимфоидных тканях с помощью проточной цитометрии. Модифицированные химерными антигенными рецепторами CD4 клетки могут дифференцироваться в несколько линий.

Здесь были собраны спленоциты мышей, модифицированных химерным антигенным рецептором CD4, и окрашены на маркеры Т- и В-клеток. Клетки, отрицательные на Т- и В-клеточные маркеры, были положительными на маркеры моноцитов и макрофагов, а также на естественные клетки-киллеры. Спленоциты ВИЧ-инфицированных мышей с химерным антигенным рецептором CD4 стимулировали либо ВИЧ-инфицированными, либо неинфицированными клетками Т-один, и было показано, что они внутриклеточной продукции цитокина.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конструировать гуманизированных мышей BLT, модифицированных химерными антигенными рецепторами. После освоения этой техники ее можно выполнить за 48 часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости работать в стабильном темпе и обращать пристальное внимание на состояние оперируемой мыши.

Для новичков важно попрактиковаться в хирургии и глазных инъекциях, прежде чем работать с более ценными тканями и стволовыми клетками. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области ВИЧ и других инфекционных заболеваний к изучению патогенеза заболевания и иммунотерапии в гуманизированной мышиной модели.