Коррелятивное световой и электронной микроскопии для изучения микроглии взаимодействий с бета-амилоидных бляшек

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать бета-амилоидные бляшки в срезах мозга на мышиных моделях с болезнью Альцгеймера перед предварительным иммуноокрашиванием и обработкой тканей для электронной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроиммунологии, такие как взаимодействие микроглиальной клетки с синапсисом вблизи бета-амилоидных участков. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет предварительно провести скрининг участков мозговой ткани, содержащих бета-амилоидные участки в областях и слоях, представляющих интерес.

Хотя этот метод может быть применен к болезни Альцгеймера, он также может быть применен к любым другим заболеваниям или тканям, где присутствует амилоидоз. Для начала приготовьте пять миллиграммов на миллилитр раствора соединения метокси Х04. С помощью весов микро вес пять миллиграмм метокси X04.

Под вытяжным шкафом растворите метокси X04 в 100 микролитрах ДМСО и размешайте до получения прозрачного зеленоватого раствора. Последовательно добавьте 450 микролитров пропиленгликоля и 450 микролитров фосфатно-солевого буфера, помешивая. Держите раствор при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующий день должна быть видна желтовато-зеленая эмульсия. После введения метокси Х04 добавьте дозу 10 мг на килограмм массы тела и, принеся животное в жертву в нужный момент времени согласно утвержденным методам, трижды промыть параормальдегид фиксированного мозга охлажденным PBS. Затем, используя острое лезвие бритвы, удалите обонятельную луковицу и разрежьте мозг коронально на две-три части примерно одинаковой высоты, все из которых можно разрезать одновременно, чтобы ускорить процедуру.

Приклейте кусочки мозговой ткани на пластину для образцов, закрепленную в лотке. Следите за тем, чтобы гладкая поверхность среза плотно прилегала к пластине образца. Добавляйте раствор PBS в лоток до тех пор, пока вся поверхность мозга не будет полностью погружена.

Поместите лоток в вибратом и отрегулируйте настройки вибратома так, чтобы получить секции толщиной 50 микрон. Начните резку, а при просеивании немедленно перенесите срезы в PBS с помощью тонкой кисти. В качестве альтернативы секции могут быть помещены в стеклянные флаконы, содержащие криозащищенный раствор, для хранения при температуре 20 градусов Цельсия.

С помощью стереотаксического атласа мозга мыши выберите участки мозга, содержащие интересующую область, и поместите каждый участок в криопротектор в лунку 24-луночного планшета для культивирования. Затем с помощью одноразовой пипетки добавьте каплю PBS на предметное стекло микроскопа, а затем поместите срез на каплю. Изучите срез под флуоресцентным микроскопом, чтобы выявить участки, содержащие метокси X04, меченные бета-бета.

Не перемещая предметный столик микроскопа, можно получать изображения интересующих областей как в светлом поле, так и в флуоресцентном режиме. На каждом изображении должна быть видна одна и та же область в обоих полях, чтобы соотнести бляшку со структурной областью участка ткани. Сохраните и назовите сделанные снимки в соответствии с номером животного.

Также запишите номер колодца на табличке и поле для сделанных фотографий. После завершения визуализации поместите срез обратно в предназначенную лунку. Исследуйте следующий участок в последовательности, используя ту же процедуру, чтобы избежать высыхания участков.

Чтобы выровнять изображения, откройте изображения светлого поля и поля UV с одинаковым ROI в ImageJ. Затем используйте плагин MosaicJ для выравнивания краев двух изображений. Сохраните выровненное и объединенное изображение в соответствии с номером колодца в папке с номером конкретного животного.

Объедините изображения с разных участков одного и того же животного, чтобы идентифицировать и локализовать бляшки в интересующей области. После завершения процесса скрининга храните исследуемые срезы при температуре 20 градусов Цельсия и представляйте собой 24-луночный культуральный планшет, содержащий криопротектор, до тех пор, пока не будет проведено иммуноокрашивание или дальнейшая обработка. Сначала приготовьте 1%-ный раствор тетраоксида осмия в фосфатном буфере в стеклянном флаконе.

Поскольку тетраоксид осмия светочувствителен, накройте стеклянный флакон алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света. После промывки в фосфатном буфере удалите буфер из секций и распределите их ровно с помощью тонкой кисти. Обязательно выровняйте срезы непосредственно перед добавлением тетраоксида осмия, так как любые складки на участках станут постоянными, а попытка сплющить ткань после фиксации осмия приведет только к поломке участков.

С помощью переводной пипетки добавляйте тетраоксид осмия в срезы по одной капле до тех пор, пока срез не будет погружен. Накройте лунку алюминиевой фольгой, чтобы защитить срезы от света, и выдержите 30 минут при комнатной температуре. Во время такой инкубации готовят пластиковую смолу в одноразовый стакан.

Соедините компоненты по порядку и хорошо перемешайте с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров до получения однородного цвета. Переложите подготовленную смесь в алюминиевые весовые тарелки. Они получат срезы тканей после того, как они будут обезвожены.

По истечении времени инкубации обезвоживайте секции в возрастающих концентрациях этанола в течение двух минут каждая. Переложите обезвоженные срезы из 24-луночного планшета для культивирования в стеклянные флаконы объемом 20 миллилитров. Затем трижды погрузите срезы в оксид пропилена каждый раз на две минуты, чтобы удалить остатки этанола.

Затем с помощью изогнутого стеклянного наконечника для пипетки или тонкой кисти перенесите срезы из раствора оксида пропилена в пластиковую смолу и оставьте на ночь для инфильтрации при комнатной температуре. После проникновения поместите алюминиевые весовые чашки с образцами в духовку при температуре от 50 до 60 градусов Цельсия на 10-15 минут. Чтобы заделать секции на листах пленки полихлортрифторэтилена, сначала с помощью тонкой кисти нанесите тонкий слой смолы на секцию.

Затем переместите по одному участку ткани с алюминиевой весовой чаши на лист пленки PCTFE. Удалите излишки смолы вокруг ткани, стараясь не потревожить ее. Переместив все секции из одной весовой чаши на лист пленки PCTFE, поместите второй лист PCTFE поверх первого, создав между двумя листами бутерброд из ткани и смолы.

Полимеризуйте смолу в инкубаторе в течение трех дней при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия. После этого ткань готова к ультратонкому срезу и ультраструктурному исследованию. На следующих изображениях показано двойное изображение одного участка гиппокампа с использованием режимов яркого поля и флуоресценции.

Области и слои интереса визуализируются под светлым полем. В то время как a-бета бляшки успешно локализуются с помощью УФ-фильтра в диапазоне от 340 до 380 нанометров. На этом изображении показан разрез гиппокампа перед предварительным иммуноокрашиванием на IBA1.

Видимая бляшка обведена пунктирной линией. На этом изображении показан тот же разрез после предварительного внедрения иммуноокрашивания на IBA1 и обработки для просвечивающей электронной микроскопии. Обратите внимание, что бляшка, окруженная пунктирной линией, все еще видна при обработке ткани для электронной микроскопии.

После освоения этого протокола его можно завершить за одну неделю при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что каждый шаг должен быть выполнен неукоснительно, чтобы снизить вероятность загрязнения и других структурных повреждений, которые могут повлиять на качество образцов. Не забывайте, что работа с осмием может быть чрезвычайно опасной, поэтому вы всегда должны принимать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и перчаток во время выполнения этой процедуры.

Обязательно выбросьте продукт после использования в конце эксперимента в соответствии с рекомендациями вашего учреждения.