Удаление экзогенных материалов из внешней части замороженных ядер по расследованию Древние биологических сообществ таил Внутри
3 июля 2016 г.
Криосфера предлагает доступ к сохранившимся организмов, которые сохранялись при прошлых условиях окружающей среды. Протокол представлен для сбора и обеззаразить вечной мерзлоты ядер почв и льда. Отсутствие экзогенного колоний и ДНК предполагают, что микроорганизмы, обнаруженные представляют Интернете, а не загрязнение от сверления или обработки.
Криосфера предоставляет доступ к сохранившимся организмам, которые существовали в условиях окружающей среды прошлого. Общая цель данной процедуры — выявить скрытое биоразнообразие путем успешного сбора и удаления экзогенного материала из замороженных кернов. Этот метод может помочь ответить на важные исторические вопросы об определенных временных периодах путем идентификации организмов, извлеченных из ледникового льда и многолетней мерзлоты.
Сбор асептического керна в полевых условиях затруднен из-за высокой вероятности занесения контаминантов. Таким образом, основным преимуществом данного метода является то, что удаление загрязнений происходит в контролируемых лабораторных условиях. Визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение, так как этапы соскабливания и деконтаминации могут быть довольно сложными для освоения.
Эта работа фактически требует участия двух человек, поэтому она предполагает большое терпение и, в особенности, слаженность действий. Эту процедуру продемонстрируют два научных сотрудника из моей лаборатории — Карен Фоли и Роберт Джонс. Данный протокол требует тщательного соблюдения чистоты.
Используйте печь, нагретую до 450 °C, для прокаливания в течение четырех часов следующих предметов: стерильных металлических решеток, не содержащих нуклеиновых кислот, стеклянной посуды, металлических пинцетов и стеклянной ваты. Чтобы предотвратить повторное загрязнение, оберните их плотной фольгой.
Затем проведите фильтрационную стерилизацию 85% ethanol и ультрачистой воды с использованием фильтров с порами 0,22 micron. Эти жидкости должны храниться при температуре четыре градуса Celsius или ниже, иначе в образце могут появиться трещины, что облегчит его контаминацию. Храните ethanol при температуре минус 20 градусов Celsius.
Храните воду при температуре 4 °C. Затем простерилизуйте пластиковую линейку 70% этанолом, после чего обработайте её раствором для деконтаминации ДНК и раствором для деконтаминации РНКаз. Сразу после нанесения каждого раствора протрите поверхность насухо.
Затем поместите линейку в стерильный пакет Whirl-Pak, не содержащий нуклеиновых кислот. Далее подготовьте помещение холодной комнаты, предварительно промыв стены, полы и находящийся в ней металлический верстак 1% раствором гипохлорита натрия. После этого установите температуру в помещении примерно на -11 °C.
После подготовки, при нахождении в холодильной камере, надевайте легкие защитные костюмы, нитриловые перчатки и маски, чтобы снизить вероятность загрязнения помещения или образцов. Данная процедура требует совместной работы двух человек. Это может быть затруднительно, учитывая многочисленные возможности для повторного загрязнения.
Для обеспечения успеха мы контролируем действия друг друга, поддерживаем связь и часто меняем перчатки. После того как всё подготовлено, перенесите стерилизованные материалы и образцы в холодную комнату и разместите их на столе, обработанном отбеливателем. Сюда входят подготовленные культуры S.marcescens.
Сначала керн многолетней мерзлоты помещают на подготовленный лист алюминиевой фольги. Затем внешнюю поверхность керна слегка инокулируют разведенной культурой S.marcescens с помощью стерильного пенопластового тампона. После этого керн устанавливают на стерильную металлическую стойку над поддоном.
Теперь стальное лезвие микротома протирают стерилизуют 70% ethanol, раствором для деконтаминации ДНК и раствором для деконтаминации РНКаз. Затем исследователь А аналогичным образом очищает свои нитриловые перчатки. После этого А держит керн под углом 45 градусов над лотком.
B осторожно счищает стерильным лезвием около пяти миллиметров с внешней поверхности всего керна, включая его концы, в то время как A поворачивает керн после каждого соскабливания. При необходимости лезвие следует повторно очищать тремя растворами. Затем B быстро и аккуратно заливает керн фильтр-стерилизованным 95%ethanol, пока A поворачивает керн.
Затем керн быстро промывают водой. Металлическую стойку над лотком заменяют, и керн помещают на новую стойку. Исследователь очищает свои нитриловые перчатки, после чего помещает керн на чистую стойку над лотком.
Тем временем оператор B распыляет по всему керну раствор для деконтаминации ДНК, после чего промывает его стерильной фильтрованной водой. Затем оператор B распыляет по всему керну раствор для деконтаминации РНКаз, после чего снова промывает его водой. В завершение керн помещают в стерильный пакет Whirl-Pak.
Начните с того, что поместите металлическую стойку на стеклянную чашку в биобоксе с ламинарным потоком воздуха. Затем поместите керн на металлическую стойку. Дайте внешней поверхности керна разморозиться на 2–5 mm в течение примерно 10 минут.
В течение этого времени каждые две минуты поворачивайте керн на 90 градусов. После размораживания захватите пинцетом немного стекловаты и протрите всю поверхность керна для сбора бактерий. Затем с помощью стекловаты произведите инокуляцию двух чашек.
Затем измерьте внешние размеры сердцевины с помощью линейки, не касаясь ее. Также инокулируйте две дополнительные чашки оригинальной культурой, которая ранее использовалась для допирования внешней поверхности сердцевины, чтобы подтвердить жизнеспособность инокулята. После этого перенесите сердцевину в большой стерильный пакет и храните при температуре -80 °C.
Инкубируйте инокулированные чашки при 23 °C в течение одной недели, после чего проверьте их на наличие колоний S.marcescens, которые при данной температуре окрашиваются в красный цвет. Несмотря на то, что данный протокол включает ряд критических этапов, одним из наиболее важных является проверка роста Serratia Marcescens. Если видимых колоний S.marcescens нет, переходите к следующей фазе размораживания.
Если обнаруживаются колонии S.marcescens, снимите еще пять миллиметров с поверхности керна и повторите процедуру. Проверьте, выросли ли S.marcescens из исходной культуры, подвергавшейся воздействию низких температур в холодильной камере. Образцы льда и многолетней мерзлоты были собраны в тоннеле длиной 110 метров, расположенном в Фоксе, Аляска.
Тоннель обеспечил доступ к богатым льдом алевритам и аллювию. Образцы собирали в трех повторностях. Описанные протоколы выполнялись на базе исследовательских центров в Нью-Гэмпшире.
Был проведен секвенирование гена 16S рРНК бактерий, выращенных из кернов. Доминировали виды Pseudomonas, но также присутствовали представители Planctomycetia. Особый интерес вызвало отсутствие видов Serratia, что свидетельствует о том, что протокол деконтаминации эффективно удалил экзогенную ДНК.
После просмотра этого видео вы должны четко представлять, как успешно провести деконтаминацию кернов льда и многолетней мерзлоты. При должном исполнении этапы обработки в холодильной камере могут быть завершены за 30–45 минут. При выполнении данной процедуры критически важно строго следить за всем, к чему вы прикасаетесь, и за чистотой всех используемых поверхностей.
При возникновении сомнений просто замените перчатки и проведите повторную стерилизацию. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как секвенирование ампликонов и дробовое метагеномное секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каков был видовой состав за этот период времени или какие функциональные характеристики преобладали в данных условиях окружающей среды.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод сбора и деконтаминации кернов многолетней мерзлоты для выявления сохранившихся организмов из прошлых экологических условий. Целью данной методики является удаление экзогенного материала при сохранении целостности образцов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Экология
- Криобиология
Теоретическая часть
- Криосфера содержит сохранившиеся организмы, которые позволяют получить представление об экосистемах прошлого.
- Сбор образцов из замороженных сред сопряжен с риском контаминации.
- Изучение микробного разнообразия прошлого может дать важные сведения для современных экологических исследований.
- Контролируемые лабораторные методы необходимы для проведения точного анализа.
Цель исследования
- Разработать надежный метод отбора кернов многолетней мерзлоты.
- Эффективно удалить загрязнения в лабораторных условиях.
- Идентифицировать и проанализировать микроорганизмы из ледникового льда и многолетней мерзлоты.
Используемые методы
- Сбор асептических кернов из многолетней мерзлоты и ледникового льда.
- Процедуры деконтаминации, проводимые в контролируемой среде.
- Визуальные демонстрации для облегчения изучения методов соскабливания и деконтаминации.
- Анализ микробной ДНК для подтверждения отсутствия контаминации.
Основные результаты
- Успешный отбор кернов многолетней мерзлоты без внесения экзогенных колоний.
- Обнаруженные микроорганизмы, скорее всего, являются автохтонными для данных образцов.
- Продемонстрированная эффективность протокола деконтаминации.
- Полученные данные о историческом микробном разнообразии.
Выводы
- Данный протокол позволяет исследовать законсервированные организмы в условиях отсутствия контаминации.
- Он способствует более глубокому пониманию условий окружающей среды в прошлом.
- Результаты данного исследования могут быть использованы в дальнейших работах по изучению микробной эволюции.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Деконтаминация замороженных кернов имеет решающее значение для точного анализа древних биологических сообществ, гарантируя, что обнаруженные микроорганизмы отражают автохтонные популяции, а не экзогенное загрязнение. Данный протокол способствует валидации целей в экологической микробиологии, обеспечивая надежное извлечение эндогенных сигналов из криоконсервированных образцов. Метод повышает достоверность прогнозов в последующих приложениях, таких какแампликонное секвенирование и метагеномика, создавая свободный от загрязнений фундамент для механистического снижения рисков при реконструкции исторических экосистем.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения нативных микробных сигналов из древней вечной мерзлоты и ледяных кернов.
- Практическая ценность: снижает риск ложноположительных результатов при идентификации мишеней за счет тщательного удаления экзогенной ДНК и микробных колоний.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем подтверждения отсутствия роста контаминантов с помощью посева Serratia marcescens.
- Практическая ценность: стандартизация подготовки образцов с помощью количественно определяемых контрольных точек деконтаминации, что повышает воспроизводимость результатов между партиями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует моделированию систем, имеющих значение для изучения заболеваний, обеспечивая доступ к древним микробным консорциумам для анализа их функциональных характеристик.
- Практическая ценность: обеспечивает трансляционную непрерывность от этапа открытия до доклинических исследований путем сохранения целостности образцов с помощью контролируемой деконтаминации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, обеспечивая надежную проверку гипотез о древнем микробном разнообразии, что напрямую способствует идентификации перспективных объектов с помощью методов секвенирования, не требующих культивирования.
- Открытия в биологии: способствуют уточнению путей и снижению биологических рисков путем подтверждения эндогенного происхождения обнаруженных микроорганизмов через отсутствие колоний Serratia, введенных в качестве внутреннего стандарта.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных этапов деконтаминации, в результате которых получаются свободные от загрязнений керны, пригодные для экстракции ДНК.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных, такие как число колониеобразующих единиц и результаты секвенирования 16S рРНК, для сравнения условий в разных образцах.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность доклинических исследований, предоставляя релевантные заболеванию системы для изучения микробной адаптации в исторических условиях окружающей среды.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования методики обработки керна, которая может быть применена в нескольких проектах по изучению ледяных кернов и многолетней мерзлоты.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования при валидации мишени за счет подтвержденного отсутствия экзогенного материала.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным контрольным точкам деконтаминации и протоколам работы в холодильной комнате.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности последующих инвестиций в секвенирование за счет снижения биологического шума.
- Влияние на портфель: Приоритизация проектов по изучению древних образцов с учетом рисков на основе подтвержденной эффективности деконтаминации.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами асептической техники и молекулярной биологии для предотвращения повторного загрязнения при манипуляциях.
- Зависит от наличия оборудования, включая холодильные камеры с температурой -11°C, оборудование, свободное от нуклеиновых кислот, и ламинарные шкафы.
- Необходима стандартизация этапов деконтаминации между исследовательскими группами, включая промывку этанолом, обработку DNAse/RNase и протоколы смены перчаток.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных типов керна (лед против многолетней мерзлоты) при соблюдении единообразного удаления внешнего слоя.
- Практическое ограничение: эффективность зависит от строгого выполнения этапов соскабливания и химической деконтаминации для исключения остаточных экзогенных сигналов.
