Трафарет Micropatterning человеческих плюрипотентных стволовых клеток для исследования пространственной организации дифференциации Судеб

Общая цель этого метода микромоделирования на основе трафаретов для плюрипотентных стволовых клеток человека состоит в том, чтобы предоставить простое и надежное средство для создания пространственных градиентов окружающей среды, которые контролируют паттерны дифференцировки стволовых клеток. Этот метод может помочь вам ответить на ключевые вопросы о структурировании тканей с использованием модели стволовых клеток человека, например, о том, как пространственные градиенты сил адгезии между клетками и клеточного матрикса могут помочь организовать судьбу дифференцировки стволовых клеток. Преимущество этого метода заключается в том, что он не требует дополнительной модификации поверхности для создания шаблонов клеевых ECM для прикрепления ячеек.

Это означает, что метод совместим с различными конфигурациями ECM и субстрата, специфичными для каждой клеточной линии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы микроструктурирования сложны для изучения. Потому что это требует точного и бережного обращения с трафаретом и ячейками.

Для этой процедуры трафареты PTMS должны быть уже спроектированы и изготовлены. Аналогичным образом, человеческие EFC-клетки должны расти на матрице базальной мембраны, чтобы колонии были готовы к посеву позже в ходе процедуры. Для начала загрузите в тарелку 700 микролитров 70% аналитического этанола в сверхчистую воду.

Затем поместите трафарет PDMS на раствор и поставьте тарелку в шкаф для биологической безопасности, чтобы она высохла на ночь. На следующий день проверьте, чтобы под трафаретом не образовались пузыри. Затем полейте чашку до тех пор, пока клетки не будут посажены на трафарет.

Приготовьте аликвоту матрицы базальной мембраны человеческого качества, добавив 16,7 миллилитров DMF12, чтобы получить 1,5-кратный раствор и держать его на льду. Обработайте подложку кислородной плазмой мощностью 100 Вт в течение 90 секунд. Не открывайте чашку, пока она не окажется внутри плазменной камеры, и быстро накройте ее после процедуры.

Такая обработка предотвратит образование пузырьков при погружении субстрата в раствор. Теперь накройте трафарет 450 микролитрами приготовленного 1,5-кратного раствора матрицы базальной мембраны. Затем запечатайте посуду парапленкой и выдержите ее в течение пяти часов.

Прежде чем продолжить, проверьте шесть лунок подготовленных колоний HESC. Идентификация и аспирация колоний дифференцированных клеток, которые утратили свою типичную морфологию HESC. Все они должны выглядеть округлыми, иметь плотно упакованную морфологию эпителия и иметь высокое соотношение ядра к цитоплазме с выступающими ядрышками.

Затем промойте каждую лунку от покрытых клеток двумя миллилитрами DMF12 два раза. После второго промывания добавьте в каждую лунку по одному миллилитру пищеварительных ферментов, таких как аккутазы, и выдержите тарелку в течение восьми минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации осторожно постучите по пластине, чтобы отделить все колонии от субстрата.

Затем промойте каждую лунку не менее чем четырьмя миллилитрами среды на каждый миллилитр пищеварительного фермента, нанесенного в лунку, и соберите клеточные суспензии в одну коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте клетки при 200 г в течение трех минут при комнатной температуре, чтобы образовалась клеточная гранула. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 400 микролитрах поддерживающей среды HESC, дополненной 10 микромоларами ингибитора горных пород.

Осторожно разрастите клетки три раза, чтобы разбить комки. Далее корректируем плотность суспензий. Хорошо перемешайте, и разбавьте 200 микролитров 1:20 в среде.

Подсчитайте клетки в разведении с помощью гемоцитометра. Затем разбавьте основную суспензию по мере необходимости, используя среду с ингибитором горных пород. Чтобы продолжить, добавьте необходимое количество ячеек на каждый подготовленный трафарет.

Отсаживать следует только монослой ячеек, поэтому распределите их равномерно. Дайте трафарету постоять в покое в течение пяти минут, чтобы клетки могли осесть. Затем аккуратно перенесите загруженные трафареты в инкубатор, сохраняя посуду ровной на протяжении всего переноса.

Дайте клеткам прикрепиться к трафаретам в течение часовой инкубации. После того, как клетки прикрепились, рассмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они прикрепились правильно. Перенесите трафарет обратно в капюшон, а неприкрепленные ячейки оторвите от трафарета.

Затем добавьте два миллилитра 0,5% совместимого неионогенного поверхностно-активного вещества в DMF12 в область вокруг трафарета. Перемешайте раствор, чтобы покрыть трафарет. Затем с помощью пары автоклавных щипцов аккуратно снимите трафарет с блюда.

После снятия трафарета осмотрите микроузоры клеток под микроскопом. Неионогенное поверхностно-активное вещество предотвращает высыхание этих клеток. Дайте микроклеткам инкубироваться в растворе с добавлением поверхностно-активного вещества в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 10 минут отасуньте раствор и промойте пластину двумя миллилитрами обычной среды DMF12 три раза. После промывки добавьте два миллилитра поддерживающей среды HESC с ингибитором горных пород. Еще раз осмотрите клетки, чтобы убедиться, что микроузоры сформировались правильно.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день аспирируйте среду, промойте клетки один раз DMF12, а затем добавьте два миллилитра добавленной дифференцировочной среды, чтобы вызвать дифференцировку клеток мезоэндодермой. Позже проанализируйте результаты.

Изготовление клеточного трафарета с помощью лазерного резака, обеспечило 1000 микронных характеристик. Трафарет состоял из тонкого трафаретного листа с микроузорчатыми сквозными отверстиями и прокладки PDMS, используемой для хранения клеток. С помощью этого инструмента были исследованы микропаттерированные ГЭКС во время дифференцировки мезоэндодермы.

Периферия колонии H9-HESC имеет более высокую адгезию интегринов, чем клетки внутри колонии. Таким образом, клетки дифференцируются в брахиарные Т-положительные клетки мезоэндодермы при индуцировании активаном, BMP4 и FGF2. Когда такие клетки были структурированы в монослои различной геометрии, геометрические и изотропные прямые углы и выпуклые кривизны, это привело к локальной концентрации интегрин-опосредованных тяговых сил и привело к увеличению дифференцировки мезоэндодермы.

Интенсивность экспрессии Т в различных местах в пределах одной колонии показала, что степень индукции мезоэндодермы действительно была выше в острых углах квадратных и прямоугольных колоний, а также на выпуклых изгибах полукруглой дуги. Это демонстрирует, что механические силы, опосредованные адгезией в ячейках, могут быть модулированы с помощью описанного метода. Прежде чем приступать к процедуре, важно оптимизировать время нанесения покрытия матрикса, переваривание клеток и время прикрепления для конкретной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, с которой вы работаете.