Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

Общей целью данной процедуры является оценка in vitro супрессивной функции регуляторных Т-клеток, выделенных от мышей, инфицированных хроническим вирусом. Этот метод может помочь ответить на вопросы о фенотипе и супрессивной функции активированных регуляторных Т-клеток in vitro при хронической вирусной инфекции. Этот метод позволяет оценить прямое воздействие регуляторных Т-клеток на индивидуума с положительным ответом на Т-клетки in vitro.

Это большое преимущество данной методики. Начните с переноса пяти раз по десять до пятой части общих лимфоцитов селезенки в 50 микролитрах буфера facs в каждую лунку нового U-образного нижнего 96-луночного планшета, а затем 150 микролитров буфера facs. Центрифугируйте планшет и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем перемешайте клеточные гранулы и промойте ячейки еще два раза в 200 микролитрах буфера facs на лунку. После второй промывки повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах коктейля антител на лунку, на 20 минут в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. Затем промойте клетки два раза в буфере facs и сцедите надосадочную жидкость.

Далее зафиксируйте клетки на 20 минут в темноте при температуре четыре градуса Цельсия 100 микролитрами фиксирующего буфера, после чего последует два промывки пермеабилизационным буфером. После второго промывания ресуспендируйте клетки в 50 микролитрах антитела против FOXP3. Чтобы приготовить шарики, покрытые анти CD3 CD28, переложите соответствующий объем магнитных шариков в 15-миллилитровую пробирку и добавьте такой же объем PPS.

Аккуратно перемешайте раствор с помощью пипетирования, и центрифугируйте магнитные шарики. По окончании стирки выбросьте надосадочную жидкость, а шарики разведите в 50 микролитрах готовой среды на лунку. Затем засейте 50 микролитров однократно умножить на десять-пятую CD4-положительную CD25-положительную регуляторную Т-клетку на лунку в 96-луночную U-образную пластину, а затем 50 микролитров однократно умножить на десять-пятую CD8-положительную реакцию Т-клеток на лунку.

Когда все ячейки будут покрыты, добавьте 50 микролитров разбавленных гранул, покрытых анти-CD3 CD28, в каждую лунку и добавьте до 50 микролитров среды, чтобы довести общий объем каждой лунки до 200 микролитров. Затем накройте тарелку фольгой и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с углекислым газом на 72 часа. Чтобы проанализировать продукцию CD8-положительных Т-клеточных цитокинов, после трех дней культивирования перенесите надосадочную жидкость в другой 96-луночный планшет и проанализируйте надосадочную жидкость с помощью иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями производителя.

Чтобы проанализировать пролиферацию CD8-положительных Т-клеток, промывайте пластину клеток с буфером facs три раза. Затем повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах соответствующего коктейля антител против пролиферировавших CD8-положительных Т-клеток в течение 20 минут в темноте при температуре 4 градуса Цельсия. В конце инкубации два раза промойте клетки в буфере FACS и зафиксируйте их на 20 минут в темноте при четырех градусах Цельсия 100 микролитрами фиксирующего буфера.

Наконец, промойте ячейки еще два раза в буфере facs и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах буфера facs. Затем измерьте процент пролиферации CD8-положительных Т-клеток, меченных филатами, с помощью проточной цитометрии. В лимфоцитах селезенки, полученных от наивных и инфицированных мышей, PD-1 специфически активируется как в обычных FOXP3-отрицательных CD4-положительных, так и в FOXP3-отрицательных CD8-положительных клетках инфицированных LCMV-клонов 13-х мышей.

Частота FOXP3-положительных CD4-положительных регуляторных Т-клеток в два раза выше у инфицированных 13-х клонированных мышей LCMV, чем у наивных мышей, при этом большинство FOXP3-положительных CD4-положительных клеток также демонстрируют активированный PD-1 высокий фенотип. CD8 Т-клетки с положительным ответом могут быть успешно разделены без значительного загрязнения другими иммунными клетками. После выделения регуляторных Т-клеток может быть получена доминантная популяция CD25-положительных CD4-положительных Т-клеток с чистотой более 80 процентов.

Стимуляция изолированных регуляторных и ответных Т-клеток гранулами, покрытыми анти-CD3 CD28, приводит к ингибированию CD8 положительных ответных Т-клеток дозозависимым образом. Действительно, когда CD8-положительные Т-клетки культивируются совместно с хроническими регуляторными Т-клетками в соотношении один к одному, пролиферация CD8-положительных Т-клеток значительно ингибируется. Продукция гамма-интерферона CD8-положительными ответящими клетками также значительно ингибируется, когда CD8-положительные Т-клетки совместно культивируются с активированными регуляторными Т-клетками хронически инфицированных мышей, по сравнению с кокультивированием с покоящимися регуляторными Т-клетками наивных мышей.

Мы обнаружили, что эту технику можно выполнить за 80 часов, если она выполнена правильно. Когда вы пытаетесь провести эту процедуру, важно помнить о необходимости использования свежевыделенных регуляторных Т-клеток сразу после их выделения. После этой разработки этот метод проложил путь исследователям в области медицины к изучению функции регуляторных Т-клеток при хроническом воспалительном заболевании.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить процедуру подавления регуляторных Т-клеток in vitro с использованием системы совместного культивирования регуляторных и ответных Т-клеток.