Создание Sub-50 Нм нанофлюидика переходов в PDMS микрожидкостных Chip с помощью процесса самосборки коллоидных частиц

Этот протокол демонстрирует новый и простой метод самосборки наночастиц коллоидного диоксида кремния для создания нанофлюидного перехода между двумя микроканалами в полидиметилсилоксане. Мембрана из шариков с размером пор около 45 нанометров, действующая в качестве катион-селективной мембраны, может быть использована для электрокинетического концентрирования образцов ДНК и белков. Обзор:На первом этапе устройство PDMS с наноловушками проходит процесс двойного формования.

После плазменного склеивания устройства со стеклянной подложкой, поверхностные функционализированные гранулы диоксида кремния впрыскиваются в микроканалы для формирования самоорганизующейся коллоидной мембраны. Наконец, напряжение подается на мембрану с помощью источника-измерителя и делителя напряжения. Истощение ионов и увеличение концентрации наблюдают с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа с ПЗС-камерой.

Приготовление суспензий коллоидных частиц диоксида кремния:Начиная с 300-нанометровых гранул диоксида кремния; вихревой запас бусин в течение 30 секунд; Выведите 600 микролитров суспензии в пробирку Эппендорфа и центрифугируйте в течение одной минуты при температуре 2 600 г. После центрифугирования осторожно удалить надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулы с 400 микролитрами одномиллимолярного буфера фосфата натрия до 15% рабочей концентрации.

Вихревом достичь однородной суспензии. Повторите те же шаги для подготовки 500-нанометровых гранул кремнезема. Для гранул карбонового кремнезема размером 500 нанометров весите 100 миллиграммов в 15-миллилитровой трубке Falcon.

Затем перелейте 9,8 миллилитров одномолярного хлорида натрия для ресуспензии шариков. Энергично закрутите трубку. Переверните трубку несколько раз, чтобы сместить бисеры, попавшие на дно.

Чтобы изменить поверхностный заряд на бусинах, мы готовим два полиэлектролита: ПАУ и ПСС. 0,9%PSS получают путем растворения 180 мг PSS с 200 миллилитрами одномолярного хлорида натрия. 0,4%-ный ПАУ получают путем введения 300 микролитров исходного раствора в 15 миллилитров одномолярного хлорида натрия.

Нанесите Vortex на оба раствора, чтобы убедиться, что они полностью растворены. Чтобы нанести положительно заряженный слой ПАУ, добавьте 200 микролитров раствора ПАУ в суспензию гранул. Встряхните вихрь в течение одной минуты и выдержите суспензию во вращателе в течение одного часа при комнатной температуре.

Чтобы смыть несвязанную ПАУ, центрифугируйте суспензию при 1,801г в течение одной минуты, чтобы высадить гранулы. Удалите надосадочную жидкость. Нанесите пипеткой один-два миллилитра воды в трубку, чтобы нарушить бусины.

Добавьте оставшиеся восемь миллилитров воды, а затем вортекс. Повторите процедуру стирки еще четыре раза. После пятой промывки и центрифуги выбросьте надосадочную жидкость и восстановите шарики 9,8 миллилитрами одномолярного хлорида натрия.

Для нанесения отрицательно заряженного слоя PSS добавьте 200 микролитров раствора PSS в суспензию шариков. Сделайте вихрь в течение одной минуты и выдержите суспензию во вращателе в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте валики пять раз деионизированной водой, как это было сделано для покрытия ПАУ

После последней стирки выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы с 650 микролитрами одномиллимолярного буфера фосфата натрия с 0,05% Tween 20. Перенесите суспензию шариков в трубку Eppendorf. Для получения 500-нанометровых аминовых гранул диоксида кремния повторите ту же процедуру, чтобы нанести один отрицательно заряженный слой PSS.

Изготовление микрофлюидного чипа PDMS: Чтобы изготовить кремниевый мастер, сначала нанесите слой фоторезиста толщиной в один микрометр со скоростью 4000 об/мин на кремниевую пластину. Затем с помощью проекционной литографии и реактивного ионного травления создаются планарные наноканалы глубиной 700 нанометров и шириной два микрометра в качестве наноловушек для бусин. Затем нанесите покрытие на 2-й слой фоторезиста со скоростью 2000 об/мин и выполните выравнивание по ранее созданным наноловушкам.

Добавьте микроканалы с помощью контактной литографии и глубокого реактивного ионного травления кремния. Чтобы создать разделительный слой, силанский мастер в вакуумной банке с 50 микролитрами трихлорсилана на ночь. Чтобы отлить форму PDMS, смешайте основание PDMS с отвердителем в соотношении 10:1.

Вылейте смесь поверх силиконового мастера. Поместите мастер с PDMS в вакуумную банку, чтобы удалить пузырьки воздуха, и запекайте его в духовке при температуре 70 градусов С, чтобы сшить PDMS. После запекания в течение двух часов аккуратно снимите плиту PDMS с силиконового мастера.

Обработайте поверхность плазмой, чтобы создать прочное сцепление с заготовкой кремниевой пластины. Прикрепите ленту вдоль края, чтобы отметить линию перегородки для следующего этапа литья PDMS. Чтобы создать слой для высвобождения пресс-формы, поместите пресс-форму PDMS в вакуумную банку на ночь.

Отлите PDMS поверх формы PDMS и переложите ее в вакуумную банку для дегазации. Затем запекаем его в духовке. Отклеить отвержденную плиту PDMS от формы PDMS по линии перегородки, отмеченной лентой.

Аккуратно отрежьте устройства и проделайте отверстия 1,5-миллиметровым пробойником для биопсии в резервуарах. После очистки поверхности скотчем и изопиловым спиртом плазмой склейте устройство PDMS на предметном стекле микроскопа размером 25 на 75 миллиметров. Сразу после плазменного соединения введите 10 микролитров суспензии во входные отверстия четвертого и шестого каналов доставки шариков.

После заполнения каналов подачи валика закройте все резервуары, кроме первого и девятого, каналов подачи валика. Высушите устройство на воздухе в течение трех часов при комнатной температуре и храните при температуре четыре градуса Цельсия перед использованием. На микрофотографиях устройства видно, как коллоидные частицы собираются внутри верхнего и нижнего каналов доставки шариков.

На СЭМ-изображении показаны самоорганизующиеся 300-нанометровые коллоидные частицы кремнезема, захваченные массивами наноловушек между образцом и буферным каналом. Заполните входные отверстия третий и седьмой буферные каналы 10 микролитрами одномиллимолярного натрийфосфатного буфера. Заполните входное отверстие пятого канала образца 10 микролитрами образца 10-наномолярной ДНК.

Подайте мягкое отрицательное давление с помощью перевернутого наконечника пипетки на все выпускные отверстия, чтобы заполнить каналы растворами без пузырьков воздуха. Добавьте 10 микролитров буфера фосфата натрия во второй и восьмой резервуары и 10 микролитров образца ДНК в резервуар 10, чтобы стабилизировать давление в течение пяти минут. Эксперимент по электрокинетической концентрации ДНК:Подключите микрофлюидный чип к делителю напряжения, подключенному к источнику измерителя.

Вставьте провода PT в резервуары три, семь, пять и 10. Подайте напряжение на наножидкостный переход. Сначала подайте напряжение 30 вольт на резервуары 5 и 10, а затем заземлите на резервуары 3 и 7.

Снизьте напряжение до 25 вольт на резервуаре 10 примерно через 30 секунд. Результаты электрокинетического предварительного концентрирования:Микрофлюидный канал заполнен ДНК с начальной концентрацией на уровне 10 наномоляров. Покадровая съемка микрофотографий показывает образование области истощения ионов, либо нанофлюидных коллоидных переходов.

Область истощения ионов была инициирована через 10 секунд. Концентрированная пробка ДНК генерировалась при подаче напряжения на канал образца, в то время как буферные каналы были заземлены. Пунктирные линии были использованы для выделения стен канала.

Коэффициент концентрации около 1700 раз достигается в течение 15 минут при использовании 300-нанометровой коллоидной мембраны. Средняя интенсивность флуоресценции ДНК увеличивается в зависимости от времени в нанопористой мембране. Пунктирные линии представляют уровень сигнала для 10-наномолярной, 17-микромолярной, двухмикромолярной и 10-микромолярной ДНК.

Концентрированная пробка образуется на нанопористой мембране из 300-нанометровых гранул кремнезема; 500-нанометровые гранулы кремнезема; 500-нанометровые гранулы кремнеземного амина, покрытые одним слоем PSS; и 500-нанометровые карбоксильные шарики кремнезема, покрытые двумя слоями ПАУ и ПСС. Выводы:Используя самоорганизующуюся коллоидную мембрану из диоксида кремния с расчетным размером пор 45 нанометров, мы продемонстрировали поляризацию концентрации ионов вблизи нанофлюидного перехода и концентрировали образец ДНК в 1700 раз в течение 15 минут. По сравнению с наноканалами на основе кремния, основным преимуществом самоорганизующейся коллоидной мембраны является возможность выполнения функционализации поверхности полностью вне герметичного микрофлюидного устройства, в отдельном флаконе.

Мы считаем, что такой подход открывает возможность быстрого изготовления микро-нанофлюидной платформы с легко настраиваемыми размерами пор, контролируя размер гранул, ионную силу или значение pH буферного раствора для изучения ионного и молекулярного транспорта в диапазоне от 10 до 100 нанометров.