Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Общая цель этих процедур заключается в визуализации и отслеживании прогрессирования перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или ИПСК. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области ИПСК, например, как кинетика перепрограммирования и эффективность перепрограммирования изменяются под воздействием используемых соматических тканей, применяемых технологий перепрограммирования и используемых с ним комбинаций матриц и сред. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует маркеры клеточной поверхности для изучения переходов соматических клеток в iPSCs, так что вы можете использовать эту технологию для мониторинга событий перепрограммирования в режиме реального времени.

На седьмой день после трансдукции промойте фибробласты двумя миллилитрами DPBS на лунку и добавьте 0,5 миллилитра 37 градусов Цельсия 05% ЭДТА в каждую лунку для трех-пятиминутной инкубации при 37 градусах Цельсия. Когда клетки округлились, остановите реакцию двумя миллилитрами фибробластной среды при температуре 37 градусов Цельсия на лунку и осторожно нанесите среду пипеткой на дно каждой лунки, чтобы вытеснить клетки. Перенесите фибробласты из каждой лунки в отдельные конические пробирки объемом 15 миллилитров и соберите их центрифугированием.

Ресуспендируйте гранулы в двух миллилитрах свежей фибробластной среды с температурой 37 градусов Цельсия и подсчитайте клетки из каждого состояния культуры. Затем засейте один раз от 10 до пятой клетки в заранее подготовленные независимые от питателя кондиционированные лунки в шестилуночном планшете для культуры тканей и инкубируйте трансдуцированные клетки в инкубаторе для клеточных культур в течение ночи. На следующий день замените среду в каждой лунке на подходящую среду для клеточного применения.

Затем поместите планшет в тепловизор и настройте программное обеспечение на непрерывную съемку фазового контраста всей лунки и флуоресцентных изображений для каждой лунки каждые шесть-восемь часов в течение следующих 14 дней. В конце эксперимента по перепрограммированию промойте лунки один раз двумя миллилитрами среды 37 градусов Цельсия DMEM/F12. Выбросьте промоутер и пометьте клетки одним миллилитром на лунку соответствующих первичных антител в свежей среде DMEM/F12 в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе.

В конце инкубации промойте клетки два раза средой DMEM/F12 с температурой 37 градусов Цельсия. Затем выбросьте промоутер и пометьте клетки одним миллилитром соответствующих вторичных антител в среде DMEM/F12 при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации промойте клетки еще два раза средой DMEM/F12.

Затем замените промывку в каждой лунке двумя миллилитрами свежей среды DMEM/F12 при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите чашку в тепловизор и откройте программное обеспечение для обработки изображений. Чтобы настроить сканирование в программном обеспечении системы обработки изображений, сначала выберите положение подноса, которое будет использоваться, и выберите тип посуды, которую нужно сканировать.

Затем выберите Whole Well Imaging, шаблон для сканирования нужных скважин и соответствующие флуоресцентные каналы для идентификации интересующих маркеров поверхности в режиме реального времени. Затем пометьте сканируемый эксперимент и установите временные точки и интервалы для образцов, которые будут сканироваться каждый день. Чтобы проанализировать набор отсканированных экспериментов, выберите интересующий вас эксперимент и нажмите кнопку Запустить новое задание анализа.

Затем выберите соответствующее определение обработки для типа анализа в соответствии с каналами, используемыми для визуализации, например, PSC Phase Colony Count. Присвойте задаче анализа имя. И выберите временной диапазон для анализа и скважин, которые будут проанализированы.

Затем запустите задание анализа. Чтобы измерить желаемые временные точки перепрограммирования по отдельным лункам, промойте интересующую лунку один раз двумя миллилитрами DPBS. Затем замените средство для стирки одним миллилитром предварительно подогретого до 37 градусов Цельсия 05% раствора трипсина-ЭДТА.

Через пять минут при температуре 37 градусов Цельсия промойте трипсин на дне лунки, чтобы диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию, и перенесите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. С помощью трех миллилитров DPBS смойте любые оставшиеся клетки из лунки и вытяните их в 15-миллилитровую трубку. Добавьте в клетки еще 10 миллилитров DPBS и раскрутите их путем центрифугирования.

Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре среды DMEM/F12 для подсчета. Затем разбавляют клеточную суспензию до концентрации в одну десятую от шести клеток на миллилитр и аликвотируют один миллилитр клеток на пробирку для соответствующего количества образцов. Затем пометьте клетки первичными антителами, представляющими интерес, в одном миллилитре среды DMEM/F12 в течение 30-45 минут при комнатной температуре при смешивании.

В конце инкубации промойте клетки два раза в среде DMEM/F12 при температуре 37 градусов Цельсия. Повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре DPBS и перенесите образцы в отдельные пробирки FACS. Получение профилей проточной цитометрии перепрограммированных планшетов.

Затем перенесите файлы FCS на компьютер и импортируйте файлы в соответствующее программное обеспечение для анализа. Откройте первый файл управления на точечной диаграмме вперед и установите ось Y в логарифмическую шкалу. Затем создайте многоугольный вентиль вокруг живой популяции.

Затем создайте боковую область рассеяния по графику высоты разброса с живыми ячейками и установите прямоугольный вентиль для исключения дублетов. Затем используйте эти вентили для анализа файлов экспериментальных образцов в соответствующих флуоресцентных каналах, чтобы определить интересующие популяции в соответствующих квадрантах. Перепрограммирование фибробластов BJ с помощью вирусов Сендая приводит к генерации SSEA4+CD44-клеток с другой скоростью, чем при перепрограммировании DF1-фибробластов, демонстрируя, что раннее сравнение процентного соотношения плюрипотентных стволовых клеток-подобных SSEA4+CD44-клеток может быть использовано для отслеживания прогрессии перепрограммирования.

В ходе проточной цитометрии CD24-CD44+ и EpCAM-отрицательные CD44+ фибробласты образуют двойные негативные популяции, которые позже переходят в CD24+CD44- и EpCAM-положительные CD44-плюрипотентные стволовые клетки, подобные соответственно, что еще больше указывает на прогрессию перепрограммирования. Визуализация перепрограммированных культур в режиме реального времени после повторного посева демонстрирует постепенное образование колоний, соответствующее логарифмическому увеличению их слияния и демонстрирующее окончательную экспрессию плюрипотентного положительного и отрицательного маркеров фибробластов по завершении перепрограммирования. Кроме того, использование репортерного гена позволяет измерить слияние при фазовом контрасте с более постепенным увеличением наблюдаемого слияния GFP по сравнению с общим слиянием.

Действительно, в этом репрезентативном эксперименте слияние GFP на 19-й день составляло менее половины от общего слияния, соответствующего полному перепрограммированию. После освоения эта техника может быть использована для выяснения информации о событиях перепрограммирования и отслеживания кинетики перепрограммирования фибробластов человека. Этот метод также может быть использован для изучения различных исходных тканей соматических клеток, используемых технологий перепрограммирования и комбинаций матриц среды для выяснения событий перепрограммирования.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать мониторинг в реальном времени и экспрессию маркеров клеточной поверхности, чтобы иметь возможность отслеживать перепрограммирование фибробластов человека в iPSCs.