Обнаружение РНК-связывающих белков In Vitro РНК спускающее в адипоцитов культуры

Общая цель этого эксперимента заключается в извлечении РНК-связывающих белков РНК-транскрипта из бурой жировой ткани. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, например, каковы регуляторные механизмы долгоживущей кодирующей РНК и связанных с ней белков РНК. Главное преимущество такой тактики в том, что ее легко выполнить.

РНК, используемая для демонстрации этой процедуры, представляет собой фрагмент нетранслируемой области антигенного рецептора 3-Prime, далее именуемой AR 3-Prime UTR. Начните с амплификации олиго T7 AR и частичной последовательности ДНК люциферазы светлячков из плазмиды psiCHECK-2. Используемые грунтовки и параметры подробно описаны в сопроводительном документе.

После амплификации используйте продукты ПЦР в качестве шаблонов для синтеза биотинилированных РНК с помощью набора для транскрипции in vitro, следуя инструкциям производителя. Затем выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. После транскрипции in vitro добавьте один микролитр Dnase в реакцию и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы разрушить матричную ДНК.

Затем доведите общий объем до 60 микролитров с водой. Нанесите биотинилированные РНК на очистительные колонки, чтобы удалить соль и неинкорпорированные нуклеотиды. Затем, после измерения концентрации РНК, храните РНКазу при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующих анализов на понижение температуры.

В день проведения анализа разморозьте замороженную биотинилированную РНК на льду. Затем, чтобы убедиться, что интересующая РНК имеет надлежащую вторичную структуру, нагрейте 50 микролитров ее при температуре 90 градусов Цельсия в течение двух минут. Охладите на льду в течение двух минут.

Затем добавьте 50 микролитров структурного буфера 2X РНК и дайте РНК сложиться при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем ресуспендируйте магнитные шарики, покрытые стрептавидином, в их оригинальном флаконе, кратковременно завихрив их. Затем перелейте 150 микролитров ресуспензирных шариков в 1,5-миллилитровую трубку.

Поместите трубку в магнитную подставку на одну минуту, чтобы отделить магнитные шарики и надосадочную жидкость. С помощью пипетки удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Сохраните гранулу гранулы.

Промойте бусины один раз, повторно суспензив гранулу шарика в одном миллилитре рекомендованного производителями 1X связующего и промывочного буфера, а затем поместите трубку на вращатель на пять минут при комнатной температуре. Промойте буфером А и буфером В дважды. После инкубации выбросьте надосадочную жидкость и сохраните гранулы.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах 2X промывочного и связующего буфера. Разделите бусины поровну на три пробирки по 1,5 миллилитров по 100 микролитров бусин в каждой пробирке. Добавьте 100 микролитров воды, не содержащей РНКазы, 100 микролитров биотинилированной РНК люциферазы светлячков и 100 микролитров биотинилированной РНК AR 3-Prime UTR.

Каждую смесь шариков инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре с вращением. Затем поместите трубки на магнит на одну минуту. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость.

Сохраните гранулы шариков. Далее промойте бусины дважды, каждый раз суспензируя гранулы шариков с 400 микролитрами 1X промывочного и связующего буфера, а затем поместите их на вращатель на пять минут при комнатной температуре. Поместите трубки на магнит на одну минуту.

Затем удалите и выбросьте всю надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте каждую гранулу в 50 микролитрах ядерного изоляционного буфера. При подготовке к следующей части протокола убедитесь, что все буферы, а также гомогенизаторы из стекла охлаждены на льду.

Приготовление клеточного лизата следует проводить на льду. Для каждого проводимого анализа на вытягивание РНК приготовьте одну 15-сантиметровую чашку с дифференцированными преадипоцитами трехнедельных мышей дикого типа C57 Black Six. Через четыре-пять дней, чтобы собрать клетки, добавьте от 10 до 15 миллилитров PBF, а затем используйте скребок для клеток, чтобы удалить клетки из чашки.

Переложите их в 50-миллилитровую пробирку, а затем гранулируйте центрифугированием при температуре 200 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре. После отжима используйте пипетку объемом в один миллилитр, чтобы аспирировать и отбросить надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах гипотонического буфера и инкубируйте клетки на льду в течение пятнадцати минут.

Перенесите клетки в гомогенизатор из наунс-стекла объемом 15 миллилитров и механически срежьте клетки на льду за 20 ударов. Гранулируйте ядра клеток центрифугированием при 3300 умноженных на G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После отжима переложите надосадочную жидкость в 1,5-миллилитровые пробирки и держите гранулу на льду для последующего использования.

К надосадочной жидкости добавляют 3-молярный хлорид калия до получения конечной концентрации 150 миллимоляр. Вращайте при температуре 20 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования сверху будет липидный слой.

Осторожно извлеките его с помощью пипетки объемом в один миллитр. Затем соберите надосадочную жидкость для цитоплазматического клеточного лизата. Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр ресуспендируйте гранулы ядер в одном миллилитре ядерного изоляционного буфера и переложите в 15-миллилитровый стеклянный гомогенизатор

Механически разрежьте ядра по льду за 100 ударов. Измельчите ядерный мусор путем центрифугирования при температуре 20 000 раз больше G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в виде ядерного клеточного лизата.

Они могут быть объединены с цитоплазматическим лизатом, собранным ранее, или храниться отдельно для последующего применения. Здесь образцы объединяются в соотношении один к одному. Добавьте ингибитор РНКазы к нефракционированному лизату клеток для получения конечной концентрации 0,5 единиц на микролитр.

Затем отложите 100 микролитров клеточного лизата на льду в качестве входного контроля для вестерн-блоттинга. Разделите клеточный лизат на три равные аликвоты с одним миллилитром клеточного лизата в каждой 1,5-миллилитровой пробирке и инкубируйте с холостыми конъюгированными РНК люциферазы светлячка и конъюгированными шариками AR 3-Prime UTR соответственно в течение трех часов при четырех градусах Цельсия с вращением. После инкубации поместите трубки на магнит на одну минуту.

Используйте пипетку объемом в один миллилитр для сбора надосадочной жидкости, затем выделите РНК и оцените целостность РНК, как описано в сопроводительном документе. Держите шарики на льду. Промойте магнитные шарики шесть раз.

Каждый раз повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре ядерного изоляционного буфера, содержащего 40 единиц ингибитора РНКазы и 0,25 процента игепала. Вращайте трубки в течение двух минут при комнатной температуре. Поместите трубки в магнитную подставку, чтобы отделить магнитные шарики и надосадочную жидкость.

Через минуту отсадите и выбросьте надосадочную жидкость, затем поместите гранулы на лед. Чтобы вымыть белковые комплексы РНК из гранул для вестерн-блоттинга, сначала ресуспендируйте каждую гранулу гранулы в 75 микролитрах ядерного изоляционного буфера. Затем добавьте 25 микролитров 4X западного блот-загружающего буфера.

содержащий SDS, для получения общего объема 100 мкл. Наконец, отварите бусины в этом 100-микролитровом растворе при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Выполните вестерн-блоттинг для проверки RBP, как описано в сопроводительном документе.

В этом эксперименте фрагмент РНК антигенного рецептора использовался в качестве приманки для захвата связывающего его белка HuR. В качестве отрицательного контроля служили как приманка из РНК люциферазы светлячка, не связанная с белком HuR, так и аликвота неконъюгированных чистых шариков стрептавидина. Взаимодействия белков РНК могут происходить как в ядре, так и в цитоплазме, и этот протокол может быть применен либо к общим, либо к фракционированным ядерным или цитоплазматическим клеткам лизатам.

Анализ с помощью вестерн-блоттинга показал белок HuR в нефракционированном клеточном лизате, или входе, с использованием моноклонального антитела. Фракция неуловимости РНК антигенного рецептора также дала положительный результат, свидетельствующий о наличии белка HuR в лизате адипоцитов с использованием РНК-конъюгированных гранул антигенного рецептора для анализа вытягивания РНК. Как фракция элюирования РНК люциферазы светлячков, так и образец пустого шарика дали отрицательные результаты, что указывает на то, что неспецифические взаимодействия не были обнаружены при использовании этого подхода.

В совокупности эти результаты позволяют предположить, что взаимодействие между фрагментом антиген-рецепторной РНК и белком HuR было специфичным. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как извлечь РНК-связывающие белки из транскрипта РНК из бурой жировой ткани. После того, как это будет освоено, это можно будет сделать за 24 часа, если это будет выполнено правильно.