Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Общая цель этой процедуры заключается в выделении двух дискретных популяций мультипотентных периваскулярных клеток-предшественников из сердечной ткани человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации сердца, такие как вклад в этот процесс подмножеств популяции периваскулярных клеток. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он приводит к популяциям клеток-предшественников с пониженной гетерогенностью и улучшенной жизнеспособности ряда основных методов эксадгезии.

Этот метод может быть использован в терапии ишемической болезни сердца, поскольку было показано, что подтипы периваскулярных стволовых клеток обладают кардиомиогенным потенциалом. Хотя этот метод может дать представление о роли периваскулярных клеток в регенерации сердца, он также может быть применен для исследования других аспектов сердечных заболеваний, таких как фиброз миокарда. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за жизнеспособного использования клеток в результате свежести тканей.

Чтобы начать эту процедуру, после удаления перикарда, магистральных сосудов и предсердий, поместите образец в промывочную среду в чашке Петри. Далее разрежьте миокард желудочков на небольшие кусочки размером примерно в один кубический миллиметр и сразу же обработайте их для получения наибольшего выхода клеток. Затем приготовьте свежий раствор для вареживания и подогрейте его до 37 градусов Цельсия на водяной бане.

После этого отфильтруйте взвешенные кусочки ткани через ситечко 100 микрон и дважды промойте их PBS. Переложите кусочки салфетки в стерильный контейнер объемом 30 миллилитров с плотно закрытой крышкой. Добавьте раствор для сбраживания и поместите контейнер в герметичный пластиковый пакет на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия, установленную на 120 оборотов в минуту.

Через 15 минут переверните емкость три раза. Затем поместите его обратно на водяную баню еще на 15 минут. После этого удалите и утолите коллагеназы пятью миллилитрами DMEM с добавлением 20% FBS.

Затем растирайте переваренную ткань, осторожно пипетируя от 10 до 20 раз серологической пипеткой объемом 10 миллилитров, чтобы разрушить любые комки ткани. Затем последовательно отфильтруйте суспензию через сетчатые фильтры с ячейками 100 микрон, 70 микрон и, наконец, 40 микрон, чтобы получить одноклеточную суспензию. После этого центрифугируют клеточную суспензию при 200 х г в течение четырех минут.

Осторожно сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера для лизирования эритроцитов в течение двух минут при комнатной температуре, прежде чем разбавить ее четырьмя миллилитрами промывочной среды. Повторите этап центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре моющей среды. Разведите 10 микролитров клеточной суспензии с 90 микролитрами промывочной среды, чтобы получить 1 к 10 разведению клеточной суспензии.

Смешайте 10 микролитров разведенной клеточной суспензии с 10 микролитрами красителя трипанового синего и поместите 10 микролитров смеси на стандартный гемоцитометр для подсчета клеток. При этой процедуре добавьте 50 микролитров мышиной сыворотки в клеточную суспензию и инкубируйте ее при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Далее центрифугируйте клеточную суспензию при 200 х g в течение четырех минут.

Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте ее в моющей среде. Затем аликвотируют 50 микролитров клеточной суспензии в каждую из двух полистирольных пробирок круглой донной проточной цитометрии для изотипа и неокрашенного контроля и помещают оставшийся объем в третью пробирку для многоцветного окрашивания. Добавьте пять антител в суспензию одиночных клеток для многоцветного окрашивания.

Аккуратно пипеткой смешайте антитела с клетками и инкубируйте все пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте. Приготовьте компенсационные контрольные бусины, добавив одну каплю положительных шариков в 100 микролитров промывочного средства в пяти проточных цитометрических пробирках. Добавьте антитела по отдельности в каждую из пяти пробирок.

Затем инкубируйте все пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте. Тем временем подготовьте пробирки для сбора клеток, в каждой из которых содержится 500 микролитров питательной среды EGM-2, и поместите их при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации антител добавьте пять миллилитров промывочной среды для промывки клеток и шариков, чтобы удалить любые несвязанные антитела.

Центрифугируйте все пробирки при плотности 200 x g в течение четырех минут. Повторите этапы промывки и центрифугирования и осторожно сцедите надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте клетки в промывочной среде в концентрации от 1 до 10 до 6-й клетки на 250 микролитров.

После этого суспензируйте бусины в 100 микролитрах моющей среды. Перенесите клеточную и бусинную суспензию в сортировщик клеток на лед в темноте. Добавьте одну каплю отрицательных шариков в контрольные трубки компенсации положительных шариков и используйте их для установки компенсации флуоресценции.

Затем запустите неокрашенные контрольные ячейки, чтобы установить фоновую флуоресценцию и установить напряжение. Затем прогоните контрольные изотипы, чтобы установить пороги фоновой флуоресценции, связанные с неспецифическим связыванием. Запустите многоцветный образец и соберите популяции перицитов и адвентициальных клеток в пробирки для сбора.

При этой процедуре добавьте 100 микролитров стерильного 0,2%-ного раствора желатина на квадратный сантиметр площади роста и перемешайте вручную, чтобы покрыть всю лунку. После этого инкубируйте пластины при температуре четыре градуса Цельсия в течение 10 минут. Затем полностью удалите желатиновый раствор.

Храните собранные клетки на льду во время подготовки культуральных планшетов. Затем центрифугируйте свежесобранные клетки при 200 x g в течение четырех минут и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в соответствующем количестве EGM-2. После этого засейте клетки на пластинах, покрытых желатином.

На этом рисунке живые клетки были забиты таким образом, чтобы сначала исключить CD45-положительные клетки, а затем CD56-положительные клетки. Затем CD144-положительные эндотелиальные клетки были удалены из CD56-негативной фракции. Из этой окончательной популяции были отобраны и впоследствии собраны CD146-положительные, CD34-отрицательные перициты и CD146-отрицательные, CD34-положительные адвентициальные клетки.

Обе культуры очищенных с помощью FACS перицитов миокарда и адвентициальных клеток демонстрируют веретенообразную морфологию звездчатых клеток. После освоения этой техники потребуется около пяти часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что самые свежие образцы обеспечат наилучший выход жизнеспособных клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как клеточная кардиомиопластика, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как пригодность этих клеток в лечении ишемической болезни сердца.