Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Общая цель данной процедуры заключается в выделении двух отдельных популяций мультипотентных периваскулярных клеток-предшественников из тканей сердца человека. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации сердца, такие как вклад различных подгрупп периваскулярных клеток в этот процесс. Основными преимуществами данной методики являются получение популяций клеток-предшественников с пониженной гетерогенностью и повышенной жизнеспособностью по сравнению с рядом основных методов экс-адгезии.

Этот метод может иметь значение для терапии ишемической болезни сердца, поскольку было показано, что подтипы периваскулярных стволовых клеток обладают кардиомиогенным потенциалом. Хотя данный метод позволяет глубже понять роль периваскулярных клеток в регенерации сердца, он также может быть применен для исследования других аспектов сердечных заболеваний, таких как фиброз миокарда. Как правило, специалистам, впервые использующим этот метод, будет сложно добиться получения жизнеспособных клеток, поскольку это напрямую зависит от свежести ткани.

Для начала данной процедуры, после удаления перикарда, крупных сосудов и предсердий, поместите образец в промывочную среду в чашку Петри. Затем разрежьте миокард желудочков на мелкие фрагменты размером примерно один кубический миллиметр и приступайте к их обработке немедленно для достижения максимального выхода клеток. После этого приготовьте свежий раствор для дигестии и подогрейте его до 37 °C на водяной бане.

После этого профильтруйте взвесь фрагментов ткани через сито с размером пор 100 микрон и дважды промойте их раствором PBS. Перенесите фрагменты ткани в стерильный контейнер объемом 30 миллилитров с плотно закрывающейся крышкой. Добавьте раствор для дигестии и поместите контейнер в запечатанный пластиковый пакет, затем установите его в встряхивающую водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и скорости 120 RPM.

Через 15 минут переверните контейнер три раза. Затем снова поместите его в водяную баню еще на 15 минут. После этого извлеките контейнер и инактивируйте коллагеназы, добавив пять миллилитров DMEM с 20% FBS.

Затем гомогенизируйте переваренную ткань, осторожно перенося ее пипеткой от 10 до 20 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 мл, чтобы разрушить любые скопления ткани. Далее последовательно профильтруйте суспензию через клеточные фильтры с размером пор 100 мкм, 70 мкм и, наконец, 40 мкм для получения суспензии одиночных клеток. После этого центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение четырех минут.

Осторожно слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов в течение двух минут при комнатной температуре, после чего разбавьте его четырьмя миллилитрами промывочной среды. Повторите этап центрифугирования и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре промывочной среды. Разбавьте 10 µL клеточной суспензии 90 µL промывочной среды, чтобы получить разведение клеточной суспензии 1 к 10.

Смешайте 10 µL разбавленной клеточной суспензии с 10 µL красителя трипанового синего и нанесите 10 µL полученной смеси на стандартную камеру Горяева (гемоцитометр) для подсчета клеток. В данной процедуре добавьте 50 µL сыворотки мыши в клеточную суспензию и инкубируйте её при 4 °C в течение 20 минут для блокирования неспецифического связывания антител. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 200 ×g в течение четырех минут.

Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в промывочной среде. Затем перенесите по 50 µL клеточной суспензии в две полистирольные пробирки с круглым дном для проточной цитометрии для изотипического и неокрашенного контролей, а оставшийся объем поместите в третью пробирку для многоцветного окрашивания. Добавьте пять антител в суспензию одиночных клеток для многоцветного окрашивания.

Осторожно перемешайте антитела с клетками с помощью пипетки и инкубируйте все пробирки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте. Подготовьте контрольные бусины для компенсации, добавив одну каплю положительных бусин в 100 microliters промывочного раствора в пяти пробирках для проточной цитометрии. Добавьте антитела по отдельности в каждую из пяти пробирок.

Затем инкубируйте все пробирки при температуре 4 °C в течение 20 минут в темноте. Тем временем подготовьте пробирки для сбора клеток, содержащие по 500 µL культуральной среды EGM-2, и поместите их при температуре 4 °C. После инкубации с антителами добавьте 5 mL промывочной среды для промывки клеток и микросфер с целью удаления всех несвязавшихся антител.

Центрифугируйте все пробирки при 200 x g в течение четырех минут. Повторите этапы промывки и центрифугирования, затем осторожно слейте супернатант. После этого ресуспендируйте клетки в промывочной среде до концентрации 1 × 10⁶ клеток на 250 µL.

После этого ресуспендируйте гранулы в 100 µL промывочной среды. Перенесите суспензии клеток и гранул в сортировщик клеток, удерживая их на льду в темноте. Добавьте одну каплю отрицательных гранул в пробирки с контролем компенсации положительных гранул и используйте их для настройки компенсации флуоресценции.

Затем проанализируйте неокрашенные контрольные клетки для определения фоновой флуоресценции и настройки напряжений. После этого проанализируйте изотипические контроли для установления порогов фоновой флуоресценции, связанных с неспецифическим связыванием. Проанализируйте образец с многоцветным окрашиванием и соберите популяции перицитов и адвентициальных клеток в пробирки для сбора.

В данной процедуре добавьте 100 µL стерильного 0,2% раствора желатина на квадратный сантиметр площади роста и перемешайте вручную, чтобы полностью покрыть поверхность лунок. После этого инкубируйте планшеты при 4 °C в течение 10 минут. Затем полностью удалите раствор желатина.

Держите собранные клетки на льду во время подготовки культуральных планшетов. Затем центрифугируйте свежесобранные клетки при 200 x g в течение четырех минут и аккуратно ресуспендируйте клеточный осадок в соответствующем объеме EGM-2. После этого высейте клетки на планшеты, покрытые желатином.

На этом рисунке живые клетки были отобраны с помощью гейтинга: сначала были исключены CD45-положительные клетки, затем CD56-положительные. После этого из CD56-отрицательной фракции были удалены CD144-положительные эндотелиальные клетки. Из полученной конечной популяции были выбраны и впоследствии собраны CD146-положительные CD34-отрицательные перициты и CD146-отрицательные CD34-положительные адвентициальные клетки.

Обе культуры перицитов миокарда и адвентициальных клеток, очищенные с помощью FACS, характеризуются веретенообразной или звездчатой морфологией клеток. После освоения данной методики ее выполнение займет около пяти часов при условии правильного соблюдения всех этапов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что использование максимально свежих образцов обеспечит наилучший выход жизнеспособных клеток.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как клеточная кардиомиопластика, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о пригодности этих клеток для лечения ишемической болезни сердца.