Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в Brucella Инфицирование клеток HeLa

Общая цель этого высокопроизводительного микроскопического анализа заключается в выявлении факторов хозяина, участвующих в инфекции клеток HeLa бруцеллой. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогена хозяина, такие как идентификация белков хозяина, которые либо способствуют, либо предотвращают колонизацию внутриклеточным патогеном Brucella. Основное преимущество этого метода заключается в том, что полуавтоматизированный рабочий процесс от ветеринарной лаборатории до анализа изображений позволяет использовать роботов и эффективно создавать эксперименты с высокой пропускной способностью.

Таким образом, этот метод может дать представление о взаимодействиях Brucella с хозяином с помощью скрининга миРНК. Большая часть протокола может быть применена к другим стратегиям скрининга. Например, или библиотеки миРНК.

После культивирования клеток HeLa и подготовки скрининговых планшетов с миРНК по текстовому протоколу разморозить черную 384-луночную пластину центрифугированием при 300-кратном перегрузке и комнатной температуре в течение 20 минут. Приготовьте трансфекционную среду с использованием dmem комнатной температуры без FCS. Развести реагент для трансфекции один к 200 и тщательно перемешать перед применением.

С помощью дозатора реагентов добавьте по 25 микролитров трансфекционной среды в каждую лунку 384-луночной пластины и перемешайте растворы, перемещая пластину вперед и назад. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы обеспечить образование комплекса реагентов для трансфекции миРНК. Тем временем подготовьте клетки HeLa, аспирировав питательную среду и добавив 2,5 мл 0,05% трипсина ЭДТА в PBS, чтобы один раз промыть субсливающиеся клетки колбы площадью 75 квадратных сантиметров.

Затем добавьте 1,5 миллилитра свежего трипсина и перенесите колбу до 37 градусов Цельсия на две-три минуты, пока клетки не округляются. Используйте 10 миллилитров предварительно подогретого dmem 60% FCS для ресуспендирования клеток. Затем используйте автоматический счетчик клеток для подсчета клеток перед приготовлением клеточной суспензии в 10 000 клеток на миллилитр в дмем с 16% FCS.

Добавьте по 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку реагента для трансфекции. В результате получается 500 клеток на лунку. Двигайте пластину вперед и назад, чтобы равномерно распределить ячейки.

Затем оставьте тарелку при комнатной температуре на пять-10 минут, чтобы клетки успокоились. Используйте парапленку для герметизации пластины. И инкубируйте его во влажном инкубаторе на предварительно подогретой алюминиевой пластине при температуре 37 градусов Цельсия с 5% C02 в течение 72 часов.

Работа с патогеном третьего класса B.abortus опасна, и необходимо соблюдать местные правила биобезопасности, которые включают ношение защитного комбинезона, защитных перчаток, маски и очков. За сутки, до заражения, проводят инокуляцию ранее определенного количества закваски B.abortus в 50 миллилитров среды TSB KM. В бутылке объемом 250 миллилитров с завинчивающейся крышкой.

Используйте парапленку, чтобы запечатать бутылку и выращивать бактерии в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 100 об/мин на шейкере до оптической плотности от 600,8 до 1,1. Измерьте оптическую плотность 600 бактериальной культуры. И приготовьте инфекционную среду, разбавив бактериальную культуру в dmem 10% FCS для достижения желаемой кратности инфекции.

Или, MOI. С помощью автоматизированной мойки пластин замените трансфекционную среду на 50 микролитров инфекционной среды. Внутри колпака перенесите планшет в клетку центрифуги и центрифугируйте 384-луночный планшет при 400-кратном перегрузке и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Затем с помощью парапленки запечатайте пластину и инкубируйте ее на предварительно нагретой алюминиевой пластине при температуре 37 градусов Цельсия и 5% C02 в течение четырех часов. После инкубации с помощью автоматической промывки пластин используйте dmem с 10% FCS, содержащим 100 мкг на миллилитр дентримизена или GM для промывания клеток с целью инактивации внеклеточных бактерий. Затем с помощью парапленки запечатайте пластину и поместите ее обратно на предварительно нагретую алюминиевую пластину в инкубаторе еще на 40 часов для анализа конечной точки.

Чтобы закрепить клетки, сначала используйте PBS для промывки лунок. Затем замените PBS на 50 микролитров 3,7% PFA. Во 2 при pH 7,4.

И инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубации используют 50 микролитров PBS для замены фиксирующей среды. Окрашивание образцов с помощью автоматической промывки пластин начинается с использования 50 микролитров 1% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут для проникновения в клетки.

После использования PBS для промывания клеток трижды добавьте 50 микролитров PBS с одним микрограммом на миллилитр DAPI и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем используйте PBS, чтобы трижды промыть клетки, прежде чем защитить их от света. Перенесите планшет в автоматический микроскоп.

Настройте параметры микроскопа. Выберите субъективное значение 10-Х. Затем выберите формат пластины, соответствующий 384-луночной пластине.

Приобретайте девять участков на скважину. Выберите Включить лазерную фокусировку. И сосредоточьтесь на тарелке и дне.

Затем установите первую хорошо полученную в качестве начальной лунки для поиска образца и всех участков для автофокусировки сайта. Далее для канала DAPI вручную отрегулируйте смещение по оси Z для фокусировки. Затем нажмите Find Sample, чтобы сфокусироваться на дне лунки.

С помощью функции AutoExposure можно получить хорошую оценку времени экспозиции. Вручную корректируйте время экспозиции для канала DAPI, чтобы обеспечить широкий динамический диапазон с низким передержкой. Используйте это время экспозиции, чтобы получить изображение нескольких участков по всей пластине.

И регулируйте время экспозиции вручную, пока самые яркие пиксели не достигнут примерно 80% от максимальной яркости на сайтах. Повторите шаги по установке фокуса и времени экспозиции, соответственно для всех остальных каналов. Затем начните сбор полной пластины.

Для анализа конечной точки используйте каналы DAPI и GFP для получения изображения всей пластины. Чтобы запустить анализ изображений на окрашенных ячейках в конечной точке, после расчета модели затенения, в соответствии с текстовым протоколом в разделе Просмотр настроек вывода выберите входную папку с изображениями и выходную папку с результатами. Затем определите текст, который является общим для изображений, и загрузите модели затенения.

Нажмите Запустить тестовый режим и убедитесь, что настройка паузы и отображения для всех модулей отключена. Включите настройку паузы и отображения для модуля девятого ImageMath. Включенный символ паузы будет отображаться желтым цветом.

Включенная функция отображения будет отображаться в виде открытого глаза. Затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы запустить анализ до девятого модуля. В девятом модуле отрегулируйте параметр, умножающий второе изображение на значение, которое будет подавлять сигнал DAPI в бруцелле без подавления ядер.

Чтобы проверить значения для модуля, нажмите Step. Щелкните правой кнопкой мыши по только что открывшемуся изображению и установите контрастность изображения на log normalized. Повторяйте шаги назад к девятому модулю.

Отрегулируйте параметр, умножьте второе изображение на и снова пройдите по модулю до тех пор, пока сигнал Бруцеллы не будет полностью подавлен, в то же время черные области, указывающие на чрезмерное вычитание, будут сведены к минимуму. Поиск хороших параметров для определенных модулей требует постепенной оптимизации параметров. Безусловно, важно многократно переступать через модули, пробуя разные значения и наблюдая за влиянием на отображаемый результат.

Включите паузу и отображение для модуля 10. Определите основные объекты. Установите нижнюю границу параметра на пороге, достаточно большую, чтобы ядра сегментировались, а фон игнорировался.

Чтобы определить шаг хорошего значения по модулю, щелкните правой кнопкой мыши на входном изображении и отобразите гистограмму там, где пик обычно указывает на фон. Начиная с интенсивности фона, увеличивайте параметр до тех пор, пока не будет достигнута хорошая сегментация ядер, как показано на выходном изображении. Целью конвейера анализа изображений является идентификация клеток, содержащих реплицирующиеся бактерии.

Это достигается за счет установки различных порогов для сигнала патогена в ядре, перинуклеусе и теле клетки Вороного. Включите паузу и отображение для модуля 15. Отфильтруйте объекты, как показано ранее, и нажмите Выполнить.

Установите минимальное значение параметра достаточно высоким, чтобы в ядре сохранялись только клетки с хорошо видимыми бруцеллами, а все остальные отфильтровывались. Чтобы определить хорошее значение, выполните шаг по модулю и отобразите выходное изображение. Увеличивайте значение ступенчато до тех пор, пока не останутся только клетки с хорошо видимыми бруцеллами в ядре.

После фильтрации на наличие клеток с бактериями в околоядре и теле клетки Вороного в модулях 16 и 17 по текстовому протоколу выйдите из тестового режима и снимите галочки со всех символов глаз рядом с модулями, чтобы убедиться, что ни один из модулей не показывает свое отображение до проведения полного анализа. Наконец, нажмите «Проанализировать изображения», чтобы начать анализ. Когда анализ будет завершен, проверьте полученные изображения в формате PNG, а также электронную таблицу CSV, чтобы убедиться, что анализ надежно работал по всей пластине.

Проведите входной анализ и оценку инфекций в соответствии с текстовым протоколом. На этом рисунке показан пример анализа изображений, используемого для автоматической идентификации инфицированных клеток в анализе конечной точки. Были идентифицированы ядра клеток HeLa, окрашенные DAPI.

Перинуклеус шириной восемь пикселей, окружающий ядро. И было рассчитано тело клетки Вороного по длине ядра, на 25 пикселей. Клетка считалась инфицированной, если сигнал патогена превышал соответствующий порог хотя бы в одном компартменте.

Бруцелла нуждается в действующих перестройках для успешного взаимодействия клеток-хозяев. Таким образом, истощение ARP23 является подходящим положительным контролем для скрининга миРНК. Истощение ARPC3 уменьшало количество клеток с пролиферирующими бактериями через два дня после заражения.

По сравнению с скремблированными обработанными контролируемыми клетками. Автоматизированный анализ изображений количественно показал снижение инфицирования истощенных ARPC3 клеток HeLa по сравнению с контролируемыми клетками на этом графике. Истощение ARPC3 также показало снижение инфекции Brucella в анализе на входе по сравнению с контролируемыми клетками.

Как видно по уменьшенному количеству внутриклеточных бруцелл, изображенных желтым цветом. Наконец, количественная оценка инфекции с помощью автоматизированного анализа изображений подтвердила, что количество инфицированных клеток, а также количество внутриклеточных бактерий в инфицированных клетках уменьшалось за счет истощения ARPC3. После освоения этот протокол может дать результаты анализа изображений в течение полутора недель после начала эксперимента.

При выполнении этой процедуры важно внимательно изучить результаты анализа изображения, чтобы убедиться, что выбранные параметры хорошо работают по всей пластине. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как визуализация клеток жизни, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, когда вы торгуете, определенный фактор хозяина взаимодействует с бруцеллой.

Или как истощение гена влияет на внутриклеточную динамику инфекции. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии инфекций к изучению факторов хозяина, необходимых для инфекции бруцеллы, в анализе клеток HeLa. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать факторы хозяина, которые способствуют или предотвращают успешную колонизацию клеток HeLa внутриклеточным патогеном Brucella abortus.

Не забывайте, что работа с Brucella abortus может быть чрезвычайно опасной, и необходимо строго соблюдать местные правила биобезопасности.