Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в

Общая цель данного высокопроизводительного метода анализа на основе микроскопии заключается в выявлении факторов хозяина, участвующих в инфекции клеток HeLa Brucella. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия хозяина и патогена, такие как идентификация белков хозяина, которые либо способствуют, либо препятствуют колонизации внутриклеточным патогеном Brucella. Основным преимуществом данной техники является то, что полуавтоматизированный рабочий процесс — от ветеринарной лаборатории до анализа изображений — позволяет использовать роботов и эффективно создавать высокопроизводительные эксперименты.

Таким образом, данный метод позволяет изучить взаимодействия Brucella с хозяином с помощью скрининга с использованием siRNA. Большая часть протокола может быть применена к другим стратегиям скрининга, например, к библиотекам siRNA.

После культивирования клеток HeLa и подготовки скрининговых планшетов с siRNAs в соответствии с текстовым протоколом, разморозьте черный 384-луночный планшет путем центрифугирования при 300 ×g и комнатной температуре в течение 20 минут. Приготовьте среду для трансфекции, используя DMEM комнатной температуры без FCS. Разведите реагент для трансфекции в пропорции 1:200 и осторожно перемешайте перед использованием.

С помощью диспенсера для реагентов добавьте 25 µL среды для трансфекции в каждую лунку планшета на 384 лунки и перемешайте растворы, перемещая планшет вперед и назад. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа для формирования комплексов реагента для трансфекции siRNA. Тем временем подготовьте клетки HeLa: аспирируйте культуральную среду и один раз добавьте 2,5 mL 0,05% раствора трипсина-ЭДТА в PBS для промывки субконфлюэнтных клеток в колбе площадью 75 см².

Затем добавьте 1,5 мл свежего трипсина и перенесите флакон при температуре 37 °C на две-три минуты, пока клетки не округлятся. Используйте 10 мл предварительно нагретого DMEM с 60% FCS для ресуспендирования клеток. Затем, с помощью автоматического счетчика клеток, определите количество клеток перед приготовлением клеточной суспензии с концентрацией 10 000 клеток на мл в DMEM с 16% FCS.

Добавьте по 50 µL суспензии клеток в каждую лунку с реагентом для трансфекции. Таким образом, в каждой лунке окажется 500 клеток. Аккуратно перемещайте планшет вперед-назад для равномерного распределения клеток.

Затем оставьте планшет при комнатной температуре на 5–10 минут, чтобы клетки осели. Загерметизируйте планшет парафильмом. Инкубируйте его в увлажненном инкубаторе на предварительно нагретой алюминиевой пластине при 37 °C и 5% CO2 в течение 72 часов.

Работа с патогеном B.abortus третьего класса опасности является опасной, поэтому необходимо соблюдать местные правила биобезопасности, которые включают ношение защитного комбинезона, защитных перчаток, маски и очков. За один день до инфицирования инокулируйте ранее определенное количество стартовой культуры B.abortus в 50 миллилитров среды TSB KM в бутылке с завинчивающейся крышкой объемом 250 миллилитров.

Загерметизируйте флакон парафильмом и культивируйте бактерии в течение ночи при 37 °C и 100 RPM на шейкере до достижения значения оптической плотности 600 от 0,8 до 1,1. Измерьте оптическую плотность 600 бактериальной культуры. Подготовьте инфекционную среду, разводя бактериальную культуру в DMEM с 10% FCS для достижения желаемой множественности заражения.

Или MOI. Используя автоматическую мойку планшетов, замените среду для трансфекции на 50 µL среды для инфицирования. Внутри вытяжного шкафа поместите планшет в центрифужный адаптер и центрифугируйте 384-луночный планшет при 400 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут.

Затем загерметизируйте планшет парафильмом и инкубируйте его на предварительно нагретом алюминиевом блоке при 37 °C и 5% CO2 в течение четырех часов. После инкубации с помощью автоматического мойщика планшетов промойте клетки средой DMEM с 10% FCS, содержащей 100 µg/mL дентримицина или GM, чтобы инактивировать внеклеточные бактерии. Затем снова загерметизируйте планшет парафильмом и верните его на предварительно нагретый алюминиевый блок в инкубатор еще на 40 часов для проведения конечного анализа.

Для фиксации клеток сначала промойте лунки с помощью PBS. Затем замените PBS на 50 µL 3,7% PFA в pH 7,4.

Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубации замените фиксирующий раствор, добавив 50 µL PBS. Для окрашивания образцов с помощью автоматического мойщика планшетов начните с обработки клеток 50 µL 1% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут для пермеабилизации.

После трехкратной промывки клеток в PBS добавьте 50 µL PBS с DAPI в концентрации 1 µg/mL и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем трижды промойте клетки в PBS, после чего защитите их от света. Перенесите планшет в автоматический микроскоп.

Настройте параметры микроскопа. Выберите 10-кратный объектив. Затем выберите формат планшета, соответствующий 384-луночному планшету.

Соберите данные по девяти участкам в каждой лунке. Выберите опцию «Enable laser-based focusing» (Включить лазерную фокусировку). Выполните фокусировку по планшету и дну лунки.

Затем установите первую полученную лунку в качестве начальной для поиска образца и все позиции для автофокусировки позиций. Далее в канале DAPI вручную отрегулируйте Z-смещение для фокусировки. Затем нажмите «Find Sample» (Найти образец), чтобы установить фокус на дне лунки.

Используйте функцию AutoExposure, чтобы получить приблизительное значение времени экспозиции. Вручную скорректируйте время экспозиции для канала DAPI, чтобы обеспечить широкий динамический диапазон при минимальном переэкспонировании. Используйте это время экспозиции для получения изображений нескольких участков по всему планшету.

Отрегулируйте время экспозиции вручную до тех пор, пока самые яркие пиксели не достигнут примерно 80% максимальной яркости по всем участкам. Повторите эти шаги для настройки фокуса и времени экспозиции соответствующим образом для всех остальных каналов. Затем начните сбор данных по всему планшету.

Для проведения конечного анализа используйте каналы DAPI и GFP для получения изображений всего планшета. Чтобы выполнить анализ изображений окрашенных клеток в конечном анализе, после расчета модели затенения, согласно текстовому протоколу, в разделе View output settings выберите папку с исходными изображениями и папку для сохранения результатов. Затем определите общий текстовый фрагмент в названиях изображений и загрузите модели затенения.

Нажмите Start test mode и убедитесь, что настройки паузы и отображения для всех модулей отключены. Включите настройки паузы и отображения для модуля nine ImageMath. Символ включенной паузы отобразится желтым цветом.

Включенная функция отображения будет выглядеть как открытый глаз. Затем нажмите Run, чтобы запустить анализ до девятого модуля. В девятом модуле отрегулируйте параметр multiply the second image by таким образом, чтобы подавить сигнал DAPI в Brucella, не подавляя при этом ядра.

Для проверки значений модуля нажмите Step. Щелкните правой кнопкой мыши по открывшемуся изображению и установите контрастность изображения на log normalized. Повторно вернитесь к модулю девять.

Отрегулируйте параметр «умножить второе изображение на» (multiply the second image by) и снова примените модуль до тех пор, пока сигнал Brucella не будет полностью подавлен, а черные области, указывающие на избыточное вычитание, будут сведены к минимуму. Поиск оптимальных параметров для определенных модулей требует их постепенной оптимизации. Крайне важно неоднократно применять модули, пробуя различные значения и наблюдая за влиянием на отображаемый результат.

Включите функцию паузы и отображения для модуля 10. Выполните идентификацию первичных объектов. Установите нижнюю границу параметра порога на уровне, достаточном для сегментации ядер и игнорирования фона.

Чтобы определить подходящее значение, перемещайтесь по модулю, затем щелкните правой кнопкой мыши по входному изображению и отобразите гистограмму, где пик обычно указывает на фон. Начиная с интенсивности фона, увеличивайте параметр до тех пор, пока не будет достигнута качественная сегментация ядер, отображаемая на выходном изображении. Целью конвейера анализа изображений является выявление клеток, содержащих реплицирующиеся бактерии.

Это достигается путем установки различных пороговых значений сигнала патогена в ядре, перинуклеарной области и теле клетки Вороного. Включите паузу и отображение для модуля 15. Отфильтруйте объекты, как показано ранее, и нажмите Run.

Установите минимальное значение параметра достаточно высоким, чтобы в анализе остались только клетки с отчетливо видимыми Brucella в ядре, а все остальные были отфильтрованы. Чтобы определить подходящее значение, выполните пошаговый запуск модуля и просмотрите выходное изображение. Поэтапно увеличивайте значение до тех пор, пока в выборке не останутся только клетки с четко выраженным присутствием Brucella в ядре.

После фильтрации клеток с бактериями в перинуклеарной области и теле клетки Вороного в модулях 16 и 17 согласно текстовому протоколу, выйдите из тестового режима и снимите флажки со всех значков «глаза» рядом с модулями, чтобы убедиться, что ни один из модулей не отображает данные до запуска полного анализа. Наконец, нажмите Analyze Images, чтобы начать анализ. По завершении анализа изучите полученные изображения в формате PNG, а также таблицу CSV, чтобы убедиться в надежности работы анализа по всему планшету.

Проведите анализ проникновения и оценку инфицирования согласно текстовому протоколу. На этом рисунке представлен пример анализа изображений, используемого для автоматического определения инфицированных клеток в конечном анализе. Были идентифицированы ядра клеток HeLa, окрашенные DAPI.

Вокруг ядра была рассчитана перинуклеарная область шириной восемь пикселей. Кроме того, была определена область тела клетки по методу диаграмм Вороного путем расширения области ядра на 25 пикселей. Клетка считалась инфицированной, если сигнал патогена превышал соответствующий порог хотя бы в одном из этих отделений.

Для успешного взаимодействия с клетками хозяина Brucella требуются активные перестройки цитоскелета. Таким образом, истощение ARP23 является подходящим положительным контролем для скрининга с помощью siRNA. Истощение ARPC3 привело к уменьшению количества клеток с пролиферирующими бактериями через два дня после инфицирования.

По сравнению с контрольными клетками, обработанными скремблизированной последовательностью. Автоматизированный анализ изображений количественно показал снижение уровня инфицирования в клетках HeLa с делецией ARPC3 по сравнению с контрольными клетками на данном графике. Делеция ARPC3 также привела к снижению инфицирования Brucella в анализе проникновения по сравнению с контрольными клетками.

О чем свидетельствует уменьшение количества внутриклеточных Brucella, отмеченных желтым цветом. Наконец, количественный анализ инфекции с помощью автоматизированного анализа изображений подтвердил, что при делеции ARPC3 снижалось как число инфицированных клеток, так и количество внутриклеточных бактерий в этих клетках. После освоения данный протокол позволяет получить результаты анализа изображений в течение полутора недель с момента начала эксперимента.

При выполнении данной процедуры важно тщательно проанализировать результаты анализа изображений, чтобы убедиться, что выбранные параметры работают эффективно по всему планшету. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, такие как визуализация живых клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, при изучении трафика определенного фактора хозяина, который взаимодействует с Brucella.

Или о том, как делеция гена влияет на внутриклеточную динамику инфекции. После разработки этот метод позволил исследователям в области биологии инфекций изучить факторы хозяина, необходимые для заражения Brucella в анализе на клетках HeLa. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как идентифицировать факторы хозяина, которые способствуют или препятствуют успешной колонизации клеток HeLa внутриклеточным патогеном Brucella abortus.

Не забывайте, что работа с Brucella abortus может быть крайне опасной, и необходимо строго соблюдать местные правила биологической безопасности.