Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

Общей целью этой процедуры является получение истинно индуцированных стволовых клеток трофобласта или iTSCs из фибробластов мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток, касающиеся природы барьера, отделяющего эмбриональную линию от внеэмбриональной. Основное преимущество этой методики заключается в том, что трансгенная экспрессия активируется лишь временно, что облегчает отбор стабильно преобразованных клеток.

В лаборатории второго уровня биобезопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты накройте пять 100-миллилитровых посуд пятью миллилитрами раствора поли-L-лизина, осторожно покачивая пластины, чтобы равномерно распределить раствор покрытия. Поместите посуду в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут, затем аспирируйте поли-L-лизин и ополосните посуду один раз PBS. Затем семь раз по 10-шестую тарелки по 293 Т-клеток на чашку в 10 миллилитрах 293 Т-клеток, перемешайте чашки, чтобы равномерно распределить клетки, и верните чашки в инкубатор.

На следующее утро замените питательную среду пятью миллилитрами трансфекционной среды. Затем обработайте культуры шестью микролитрами 1000-кратного запаса раствора хлорохина и поместите планшеты обратно в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Для приготовления трансфекционной смеси для каждого вектора Lentiviral добавьте 600 микролитров раствора Lentivector DNA в 600 микролитров буферизованного физиологического раствора 2X HEPES во время вортексирования и инкубируйте трансфекционную смесь при комнатной температуре.

Через 15 минут очень осторожно добавьте смесь по каплям в подготовленные 293 Т-клетки, и верните посуду в инкубатор. Через пять-шесть часов замените среду 10 миллилитрами среды для производства вируса и поместите пластины обратно в инкубатор. На следующее утро осторожно замените среду семью миллилитрами свежей среды для производства вируса для еще одной ночной инкубации.

Затем переложите среду с каждой пластины в отдельные 15-миллилитровые конические пробирки и добавьте семь миллилитров свежей среды для производства вируса на пластины для еще одной ночной инкубации. На следующее утро соберите вторую партию вируссодержащей среды, объединив надосадочную жидкость с первой партией вируса, и процедите вируссодержащую среду через мембранный фильтр свободного ацетата целлюлозы с поверхностно-активным веществом 0,45 микрона для хранения в 500 микролитровых аликвотах при температуре минус 80. Чтобы преобразовать фибробласты в индуцированные стволовые клетки трофобласта, дважды промойте трансдуцированные эмбриональные фибробласты или MEF двумя миллилитрами PBS.

Затем отделите клетки 0,5 миллилитрами раствора Трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия. Через три-четыре минуты подтвердите, что клетки оторвались от планшета под перевернутым микроскопом, а затем активируйте трипсин одним миллилитром TS-среды. Переложите клеточные суспензии в отдельные конические пробирки объемом 15 миллилитров и центрифугируйте клетки.

Затем повторно суспендируйте гранулы в двух миллилитрах TS среды и дважды по 10 до пятой четырехфакторной mCherry или контролируйте нетрансдуцированные MEF на 100 миллилитровую чашку в 10 миллилитров TS среды, содержащей фактор роста фибробластов четыре и гепарин с добавлением доксициклина для ночного культивирования. На следующий день под эпифлуоресцентным микроскопом используйте экспрессию белка mCherry для оценки эффективности трансдукции. Если эффективность трансдукции составляет около 100%, верните культуры в инкубатор, меняя среду во всех посудах через день до 10 дня.

После этого скармливайте клеткам свежую среду TS, содержащую фактор роста фибробластов четыре и гепарин без доксициклина, используя инвертированный микроскоп для мониторинга появления трансдифференцированных областей на чашке четырех факторов в течение трех недель. Идентификация трансдифференцированных областей имеет решающее значение, поскольку на данный момент MEF морфологически не похожи на стволовые клетки трофобласта. Ищите плотно нагроможденные колонии, примыкающие к гигантским клеткам трофобласта, которые идентифицируются по размеру клеток и большому ядру.

Чтобы изолировать отдельные линии iTSC, сначала протрите инвертированный микроскоп 70% этанолом, чтобы свести к минимуму вероятность бактериального загрязнения. Затем добавьте 40 микролитров 05% Trypsin EDTA в 12 лунок нижней луночной пластины 96 U и положите пластину на лед. Теперь аспирируйте среду из четырехфакторной чашки для трансдифференцировки MEF и промойте клетки один раз 10 миллилитрами PBS.

После промывки добавьте в клетки 10 миллилитров свежего PBS и поставьте пластину на инвертированный предметный столик микроскопа. С помощью пипетки объемом 100 микролитров, установленной на 40 микролитров, обведите каждую отдельную колонию наконечником пипетки и отасуньте получившуюся плавающую колонию. Перемещайте каждую колонию в отдельные лунки на 96-луночной пластине, пока не будет выбрано 12 колоний.

Затем инкубируйте колонии при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. В конце инкубации диссоциируйте клетки с помощью пипетирования и перенесите клеточные суспензии в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего 500 микролитров полного TS плюс фактор роста фибробластов и гепариновую среду для ночного культивирования. На следующий день замените среду свежим полным TS плюс фактором роста фибробластов и средой гепарина, чтобы удалить мертвые клетки и вернуть планшет в инкубатор.

Ежедневный мониторинг культур на предмет появления эпителиальных колоний с яркими границами. Когда колонии наблюдаются, культивируйте клетки в течение одной недели или до тех пор, пока они не станут на 70% слитыми. В культурах, где активируется экспрессия трансгена четырехфакторного фактора, клетки быстро изменяют морфологию.

Примерно на 14-21 день появляются отчетливые трансдифференцированные области. Эти первичные колонии лишены типичной морфологии стволовых клеток трофобласта, однако после их субкультивирования наблюдается характерная морфология эпителия с узкими краями и яркими границами, очень напоминающая настоящие стволовые клетки трофобласта. Когда индуцированные четырехфакторные стволовые клетки трофобласта остаются положительными для фактора транскрипции трофобласта, Cdx2 и Tfap2c, идея этих линий может быть использована для последующих анализов in vitro или inVivo.

После освоения этой техники ее можно завершить за шесть недель, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как бластная инъекция, чтобы ответить на дополнительные вопросы о потенциале химеризации генерируемых iTSC. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области сегрегации ранних линий для изучения эмбриональной и внеэмбриональной клеточной трансформации у мышей.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как напрямую конвертировать новые эмбриональные фибробласты в индуцированные стволовые клетки трофобласта. Не забывайте, что работа с лентивирусными векторами может быть чрезвычайно опасной, и что всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих рабочих процедур второго уровня биобезопасности.