Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в получении истинных индуцированных стволовых клеток трофобласта (iTSCs) из фибробластов мыши. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток, касающиеся природы барьера, разделяющего эмбриональную и экстраэмбриональную линии. Основным преимуществом данной методики является то, что трансгенная экспрессия активируется лишь временно, что облегчает селекцию стабильно конвертированных клеток.

В лаборатории второго уровня биобезопасности, используя соответствующие средства индивидуальной защиты, заполните пять чашек объемом 100 мл пятью миллилитрами раствора Poly-L-lysine, аккуратно покачивая чашки для равномерного распределения раствора покрытия. Поместите чашки в инкубатор при температуре 37 °C на 30 минут, затем аспирируйте Poly-L-lysine и один раз промойте чашки раствором PBS. Далее высейте по 7 × 10⁶ клеток 293 T в каждую чашку в 10 мл среды для клеток 293 T, перемешайте содержимое чашек круговыми движениями для равномерного распределения клеток и верните их в инкубатор.

На следующее утро замените ростовую среду пятью миллилитрами среды для трансфекции. Затем обработайте культуры шестью микролитрами 1000-кратного стокового раствора хлорохина и верните планшеты в инкубатор при 37 °C. Для приготовления смеси для трансфекции для каждого лентивирусного вектора по каплям добавьте 600 микролитров раствора ДНК лентивектора в 600 микролитров 2X HEPES-солевого буфера при перемешивании на вортексе, после чего инкубируйте смесь для трансфекции при комнатной температуре.

Через 15 минут очень осторожно добавьте смесь по каплям к подготовленным клеткам 293 T и верните чашки в инкубатор. Через пять-шесть часов замените среду на 10 мл среды для продукции вируса и снова поместите планшеты в инкубатор. Следующим утром осторожно замените среду на семь мл свежей среды для продукции вируса для еще одной инкубации в течение ночи.

Затем перенесите среду с каждой чашки в отдельные конические пробирки объемом 15 milliliter и добавьте на чашки семь milliliters свежей среды для продукции вируса для еще одной инкубации в течение ночи. На следующее утро соберите вторую порцию среды, содержащей вирус, объединив супернатант с первой порцией вируса, и профильтруйте среду, содержащую вирус, через мембранный фильтр из целлюлозно-ацетатного материала без ПАВ с размером пор 0.45 micron для хранения в аликвотах по 500 microliter при температуре минус 80. Чтобы конвертировать фибробласты в индуцированные стволовые клетки трофобласта, дважды промойте трансдуцированные эмбриональные фибробласты мыши или MEFs двумя milliliters PBS.

Затем отделите клетки, добавив 0.5 мл раствора трипсина-ЭДТА при 37 °C. Через три-четыре минуты убедитесь с помощью инвертированного микроскопа, что клетки открепились от планшета, после чего инактивируйте трипсин, добавив 1 мл среды TS. Перенесите клеточные суспензии в отдельные конические пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте клетки.

Затем ресуспендируйте осадки в двух миллилитрах среды TS и высейте 2 × 10⁵ MEF, экспрессирующих mCherry или контрольных нетрансдуцированных MEF, на чашку 100 мм в 10 миллилитрах среды TS, содержащей фактор роста фибробластов 4 и гепарин с добавлением доксициклина, для культивирования в течение ночи. На следующий день под эпифлуоресцентным микроскопом оцените эффективность трансдукции по экспрессии белка mCherry. Если эффективность трансдукции составляет около 100%, верните культуры в инкубатор, заменяя среду во всех чашках каждые два дня до 10-го дня.

После этого замените среду на свежую среду TS, содержащую фактор роста фибробластов 4 и гепарин, без доксициклина; используйте инвертированный микроскоп для мониторинга появления трансдифференцированных участков в чашке с четырьмя факторами в течение периода до трех недель. Идентификация трансдифференцированных участков имеет решающее значение, так как на данном этапе МЭФ морфологически не напоминают стволовые клетки трофобласта. Ищите плотные многослойные колонии, прилегающие к гигантским клеткам трофобласта, которые определяются по размеру клеток и крупному ядру.

Для изоляции отдельных линий iTSC сначала протрите инвертированный микроскоп 70% ethanol, чтобы минимизировать вероятность бактериального загрязнения. Затем добавьте 40 µL 0.5% Trypsin EDTA в 12 лунок 96-луночного планшета с U-образным дном и поместите планшет на лед. Теперь аспирируйте среду из чашки для трансдифференцировки MEF с четырьмя факторами и один раз промойте клетки 10 mL PBS.

После промывки добавьте к клеткам 10 milliliters свежего PBS и поместите планшет на предметный столик инвертированного микроскопа. Используя дозатор на 100 microliter, установленный на 40 microliters, обведите кончиком дозатора каждую отдельную колонию и аспирируйте полученную плавающую колонию. Перенесите каждую колонию в отдельные лунки планшета на 96 лунок, пока не будет отобрано 12 колоний.

Затем инкубируйте колонии при 37 °C в течение пяти минут. По завершении инкубации диссоциируйте клетки путем пипетирования и перенесите клеточные суспензии в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего 500 µL полной среды TS с добавлением фактора роста фибробластов и гепарина, для культивирования в течение ночи. На следующий день замените среду на свежую полную среду TS с фактором роста фибробластов и гепарином, чтобы удалить погибшие клетки, и верните планшет в инкубатор.

Ежедневно контролируйте культуры на предмет появления эпителиальных колоний с четкими границами. При обнаружении колоний культивируйте клетки до одной недели или до достижения 70% конфлюэнтности. В культурах, где активирована экспрессия трансгена четырех факторов, клетки быстро меняют морфологию.

Примерно на 14–21 день появляются отчетливые зоны трансдифференцировки. Эти первичные колонии не обладают типичной морфологией трофобластных стволовых клеток, однако после субкультивирования наблюдается характерная эпителиальная морфология с плотными краями и четкими границами, весьма напоминающая истинные трофобластные стволовые клетки. Если индуцированные четырьмя факторами трофобластные стволовые клетки сохраняют экспрессию факторов транскрипции трофобласта Cdx2 и Tfap2c, данные линии могут быть использованы для последующих анализов In vitro или In Vivo.

После освоения эта методика может быть выполнена за шесть недель при условии ее правильного применения. После данной процедуры можно использовать другие методы, такие как инъекция с помощью бластера, для получения дополнительных ответов на вопросы о потенциале химеризации полученных iTSCs. После разработки эта техника открыла исследователям в области ранней сегрегации линий возможность изучить конверсию судьбы эмбриональных и внеэмбриональных клеток у мышей.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как напрямую конвертировать эмбриональные фибробласты в индуцированные стволовые клетки трофобласта. Не забывайте, что работа с лентивирусными векторами может быть крайне опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как соответствующие рабочие процедуры для второго уровня биологической безопасности (BSL-2).