Получение формалином фиксированных залитых парафином тканей Ядра как для РНК и ДНК экстракции

Общая цель этой процедуры заключается в последовательном извлечении РНК и ДНК из архивных ядр тканей, залитых формалином, залитых парафином. Это протокол забора тканевых ядер, из которых мы будем извлекать как РНК, так и ДНК. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он улучшает выход РНК и ДНК из точно целевых областей в тканевом блоке.

Эта процедура в значительной степени разработана в архивных тканях рака предстательной железы. Его также можно наносить на другие виды архивных тканей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы отбора керна из тканей обычно не используются в исследовательских лабораториях.

Большинство исследовательских лабораторий используют вместо этого поперечные срезы, что быстрее истощает ткани и добавляет значительную гетерогенность образцу. Начните с просмотра предметного стекла микроскопа и обведите область интереса с помощью тонкого точечного перманентного маркера. Затем отрежьте участок парафиновой пленки достаточно большой, чтобы покрыть интересующую область на предметном стекле микроскопа.

Затем плотно положите пленку на предметное стекло, обернув пленку по краям, чтобы она не соскользнула. С помощью перманентного маркера тонкой точки очертите всю ткань и интересующую область внутри ткани. Далее снимите пленку со предметного стекла и перенесите ее на соответствующий тканевый блок.

Сориентируйте пленку, перевернув или повернув ее так, чтобы контур всей ткани соответствовал наблюдаемой форме ткани в блоке. Плотно прижмите участок пленки к поверхности блока, чтобы предотвратить соскальзывание. С помощью кончика перманентного маркера сделайте неглубокие, но заметные углубления по контуру интересующей области, а затем снимите пленку.

Затем очистите пробойник рецептора от набора пуансонов диаметром 0,6 мм, погрузив наконечник в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр отбеливателя, и несколько раз сдвинув пуансон вверх и вниз. Повторите промывку с помощью тюбика, содержащего 70 процентов этанола, а затем воды. Теперь вдавите очищенный пуансон в интересующую область на глубину трех миллиметров и извлеките.

Поместите сердцевину в микроцентрифужную пробирку с низким уровнем связывания, вытолкнув ее из пуансона с помощью стилуса. Добавьте один миллилитр ксилола в микропробирки, содержащие ядра тканей, и энергично перемешайте в течение десяти секунд. Затем поместите в термоблок, установленный на 50 градусов Цельсия, на три минуты.

После инкубации центрифугируйте в течение двух минут при комнатной температуре на максимальной скорости. После центрифугирования поместите ядра на лед на пять минут, чтобы воскообразный остаток застыл. Теперь осторожно удалите парафин, скопившийся вокруг мениска вместе с надосадочной жидкостью, с помощью наконечника пипетки.

Затем повторите обработку ксилолом. После удаления парафиновой смеси ксилола добавьте один миллилитр 100-процентного этанола и энергично ворксируйте в течение десяти секунд. После центрифугирования на максимальных оборотах в течение двух минут аккуратно выбросьте этанол.

Повторите промывку этанолом еще раз перед началом гомогенизации. Восстановите суспендию депарафинизированных ядер в 700 микролитрах 100-процентного этанола перед гомогенизацией. Используйте моторизованный гомогенизатор тканей на средней настройке, чтобы измельчить ядра в мелкие частицы.

Тщательная гомогенизация тканевых ядер необходима для оптимального выхода ДНК и РНК. Затем заполните отдельные 15-миллилитровые пробирки примерно десятью миллилитрами отбеливателя, нейтрализующим раствор РНКазы и 70-процентным этанолом. После гомогенизации образца промойте щуп гомогенизатора в каждом из чистящих растворов по порядку.

Запустите гомогенизатор на максимальную скорость во время этапа промывки. Протрите зонд салфеткой и дайте зонду полностью высохнуть перед гомогенизацией следующего образца. Визуально осмотрите лезвия зонда на наличие остатков ткани и, если они обнаружены, снова очистите зонд.

После гомогенизации доведите объем образца до одного миллилитра со 100-процентным этанолом, затем центрифугируйте на максимальной скорости в течение 15 минут. Осторожно отасуньте этанол и высушите гранулы на воздухе в течение примерно 15-20 минут перед началом экстракции протеиназы К. Повторно суспендируйте гранулы в 150 микролитрах буфера для пищеварения протеиназы К и переверните трубки, чтобы ослабить гранулу.

Для более высокого восстановления ДНК рекомендуется расщепление протеиназы К в течение ночи. Добавьте 10 микролитров термостабильной протеиназы К и перемешайте, перелистывая. Инкубировать при температуре 56 градусов Цельсия в течение 15 минут с легким перемешиванием.

Инкубируйте трубки на льду в течение трех минут. После охлаждения центрифугируйте пробирку в течение 15 минут на максимальной скорости. Далее, не тревожа гранулы, осторожно переложите каждую надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку для очистки РНК.

Извлеките РНК и ДНК с помощью оптимизированной процедуры, указанной в письменном протоколе, которая включает в себя увеличенное время расщепления тканей для экстракции ДНК. С помощью этого метода РНК и ДНК могут быть восстановлены из старых образцов тканей, инспирированных формалином, залитых парафином. Нуклеиновые кислоты были совместно экстрагированы из образцов рака предстательной железы возрастом от трех до 14 лет.

Средний выход составил 2 270 нанограммов РНК и 820 нанограммов ДНК. Интересно, что не было выявлено значимой корреляции между возрастом образца ткани и восстановлением нуклеиновых кислот. В целом, выход РНК и ДНК коррелировал между образцами, хотя в большинстве случаев было восстановлено более чем в два раза больше РНК по сравнению с ДНК.

Чтобы продемонстрировать эффективность геномной ДНК, экстрагированной с помощью этого протокола, экстракты бисульфитной преобразованной ДНК из архивных образцов рака предстательной железы были амплифицированы с помощью ПЦР, специфичной для метилирования. Повторяющиеся элементы ALU использовались в качестве контроля метилирования и показали незначительные различия между образцами. GSTP1, ген, который, как известно, гиперметилирован при раке предстательной железы, не показал обнаруживаемой амплификации с помощью метилирования, специфичной для ПЦР, когда использовалась ДНК, извлеченная из доброкачественных образцов.

Образцы ДНК пациентов с агрессивным раком предстательной железы показали обнаруживаемые пороговые значения цикла QPCR, которые были ниже, чем у клеток индолентного рака предстательной железы, что указывает на повышенное метилирование GSTP1 при агрессивном раке предстательной железы. После освоения эта техника может быть выполнена в течение трех-четырех часов для РНК, а после ночного расщепления — в течение четырех часов для ДНК, если она выполнена правильно. Этот метод должен позволить исследователям в области молекулярной патологии исследовать диагностические биомаркеры ДНК и РНК при различных видах рака.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить ядра тканей к извлечению ДНК и РНК из точно картированных областей интереса в архивных тканевых блоках.