Сравнение методов Хост клеточных белков Удаление табака с помощью Бланшировка интактных растений или путем термической обработки экстрактов
8 августа 2016 г.
Три тепла представлены методы осаждения, которые эффективно удалить более 90% белков клетки-хозяина (НСР) из экстракта табака до любой другой стадии очистки. Завод НСР необратимо агрегировать при температурах выше 60 ° C.
Общая цель данного набора экспериментов заключается в осаждении белков клеток растения-хозяина с помощью нагрева. Это облегчает последующую хроматографическую очистку рекомбинантных биофармацевтических белков. Данный метод может помочь оптимизировать разработку процесса и повысить стабильность продукта, например, за счет инактивации протеаз хозяина.
Основным преимуществом данного метода является простота его внедрения в существующие системы работы с протеазами и возможность быстрой адаптации под различные целевые белки. Процедуру продемонстрирует Ханна Гручоу, магистрантка моей лаборатории. Для термического осаждения белков клетки-хозяина.
Например, из листьев табака. После культивирования растений табака в соответствии с текстовым протоколом установите водяную баню с рабочим объемом восемь литров в термоизолированном ведре из пенополистирола. Поместите всю установку на магнитную мешалку и введите магнитный якорь в водяную баню.
Затем обложите магнитный якорь немагнитными опорными плитками так, чтобы они возвышались над якорем примерно на один сантиметр. На эти плитки в ходе процедуры позже будет установлена полипропиленовая корзина. Добавьте восемь литров буфера в водяную баню.
Затем поместите полипропиленовую корзину размером 23 на 23 на 23 сантиметра на опорные плитки. Убедитесь, что опора не препятствует вращению магнитной мешалки и что корзина полностью погружена в жидкость. Затем извлеките корзину.
Используйте регулируемый термостат, чтобы нагреть водяную баню до 70 °C. После достижения заданной температуры подождите не менее 15 минут, чтобы вся установка пришла в состояние теплового равновесия. Затем подготовьте аликвоты табачных листьев массой 150 г.
Поместите одну аликвоту в корзину, избегая необратимого сжатия и повреждения листьев, например, их разрыва. Осторожно, но быстро погрузите корзину в горячую жидкость и установите её на опорные плитки.
Затем поместите на корзину стальной блок, чтобы предотвратить всплывание. Инкубируйте листья в бланширующей жидкости в течение пяти минут или выберите время, соответствующее плану вашего эксперимента.
Следите за температурой жидкости на протяжении всего периода инкубации. После инкубации осторожно извлеките корзину из бланширующего раствора и дайте листьям стечь в течение 30 секунд. Затем достаньте листья растений из корзины, перенесите их в блендер и немедленно приступите к экстракции согласно текстовым протоколам.
Для нагрева осажденных HCP в перемешивающем устройстве установите водяную баню на магнитную мешалку и поместите двухлитровый сосуд из нержавеющей стали в водяную баню так, чтобы центр сосуда совпадал с центром мешалки. Поместите магнитный перемешивающий элемент в сосуд из нержавеющей стали.
Заполните сосуд экстракционным буфером. Затем добавьте деионизированную воду. Наполните водяную баню так, чтобы уровень воды был на пять сантиметров ниже верхнего края сосуда из нержавеющей стали.
Накройте емкость крышкой из пенополистирола. Затем вставьте термометр в стальную емкость через соответствующее отверстие в крышке. После этого установите температуру водяной бани на 78 °C и инкубируйте всю сборку в течение 15 минут для достижения теплового равновесия.
Когда система достигнет равновесия, опорожните сосуд и, не вынимая его из водяной бани, налейте в него 300 мл экстракта, после чего запустите таймер. Перемешивайте экстракт со скоростью 150 об/мин в течение пяти минут инкубации. Убедитесь, что в процессе инкубации температура экстракта поддерживалась на уровне 70 °C в течение как минимум двух минут.
После инкубации снимите водяную баню с магнитной мешалки. Извлеките сосуд из нержавеющей стали и поместите его в ведро с ледяной водой. Затем установите ведро на магнитную мешалку.
Убедитесь, что гомогенат растения тщательно перемешивается при 150 rpm. Поместите термометр в экстракт и инкубируйте его до достижения температуры 20 °C или заданной температуры. После подготовки двух водяных бань с рабочим объемом восемь литров согласно текстовому протоколу, заполните первую баню деионизированной водой.
Установите термостат на 74.5 °C и инкубируйте сборку в течение 15 минут для достижения теплового равновесия. Подготовьте изолированный контейнер для хранения, поместив пластический стакан объемом 0.5 л в пластический стакан объемом 1 л. Заполните зазоры изоляционным материалом, например, ватой.
С помощью трубок LS24 соедините теплообменник с перистальтическим насосом с одного конца и с выпускным шлангом с другого. Поместите оба конца трубок вместе с термометром в изолированный резервуар для хранения. Заполните его 300 миллилитрами экстракционного буфера.
Затем поместите теплообменник в водяную баню и запустите перистальтический насос со скоростью 300 мл/мин. Через три минуты убедитесь, что установившаяся температура в сосуде составляет 70 °C. Это примерно на 4,5 °C ниже заданного значения температуры водяной бани.
Слейте экстракционный буфер из изотермического сосуда и подготовьте аликвоты растительного экстракта объемом 300 миллилитров. Затем заполните изотермический сосуд одной аликвотой. Теперь прокачайте растительный экстракт через теплообменник со скоростью 300 миллилитров в минуту в течение пяти минут.
Затем убедитесь, что через три минуты температура экстракта составляет 70 °C или соответствует температуре, указанной в плане эксперимента. Через пять минут перенесите теплообменник в ледяную водяную баню. Перед тем как продолжить, убедитесь, что температура экстракта опустилась ниже 30 °C.
Извлеките входной шланг, подключенный к перистальтическому насосу, из термоизолированного сосуда. Продолжите перекачку, чтобы собрать остатки осажденного при нагревании растительного экстракта из теплообменника. Затем остановите насос.
Для проведения мешковой фильтрации растительного экстракта установите фильтровальный мешок в соответствующую опорную корзину, вставленную в корпус фильтра. Поместите под корзину сосуд объемом один литр и подавайте аликвоты экстракта в мешок со скоростью 150 мл/мин. После фильтрации с помощью турбидиметра измерьте мутность разведения фильтрата в экстракционном буфере в соотношении от 1:1 до 1:10.
Отберите аликвоту образца объемом 1 мл и обработайте фильтрат из пакета. Например, с помощью глубинной фильтрации и хроматографии. Далее проанализируйте образец в соответствии с текстовым протоколом.
Тепловое осаждение белков клеток-хозяев путем бланширования снижает содержание общего растворимого белка или TSP на 96 ± 1%. Бланширование позволило восстановить до 83 ± 1% DsRed и 51% целевого белка Vax8, увеличив его чистоту с 0,1% до 1,2% перед хроматографическим разделением.
Фильтрующая способность снижалась при температурах бланширования выше 63 °C. Эту проблему можно решить путем добавления флокулянтов после экстракции белков и вспомогательных фильтрующих веществ после фильтрации через мешок. Реактор с перемешиванием для термического осаждения удалял максимум 84 ± 1 % HCP.
Достигнута чистота 0,33 ± 0,02% для Vax8 и 20,2 ± 1,4% для DsRed. В отличие от бланширования и использования теплообменника, осаждение HCP в сосуде увеличивает пропускную способность последующей глубинной фильтрации в 2,5 раза. Это обусловлено более низкими силами сдвига в сосуде по сравнению с перекачиванием экстракта через теплообменник или гомогенизацией после бланширования.
При использовании теплообменника при температуре от 60 до 70 °C из экстракта последовательно удалялось примерно 88,3 ± 0,7 % содержания HCP. При этом была достигнута чистота 0,31 ± 0,01 % для Vax8 и 27,6 ± 2,0 % для DsRed.
Наконец, в теплообменнике была достигнута самая низкая пропускная способность фильтра глубинной очистки на выходе. До момента засорения было осветлено всего 13.5 ± 6.0 литров на квадратный метр. При должном исполнении и после освоения данной техники процедура занимает менее 50 минут, без учета времени на подготовку образца.
При выполнении данного метода важно убедиться, что целевой белок термостабилен. После данной процедуры можно применить другие методы, например хроматографию, для дальнейшей очистки продукта до требуемого уровня. После разработки эта методика предоставила исследователям в области растений технологию для изучения очистки белков-кандидатов вакцин и видов nicotiana.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как осаждать белки клеток растений-хозяев с помощью бланширования, перемешиваемого реактора или теплообменника.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлены три метода теплового осаждения, которые позволяют эффективно удалять более 90% белков клеток-хозяев (HCP) из экстрактов табака. Эти методы облегчают последующие этапы очистки рекомбинантных биофармацевтических белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биотехнология
- Очистка белков
- Фармацевтическая разработка
Теоретические сведения
- Белки клеток-хозяев могут препятствовать очистке рекомбинантных белков.
- Тепловое осаждение — это метод, используемый для удаления нежелательных белков.
- Эффективное удаление белков клеток-хозяев имеет решающее значение для стабильности продукта.
- Данный метод может быть адаптирован для различных целевых белков.
Цель исследования
- Разработать метод осаждения белков клеток-хозяев растений с помощью нагрева.
- Оптимизировать процесс разработки рекомбинантных биофармацевтических препаратов.
- Повысить стабильность конечного продукта.
Используемые методы
- Термическое осаждение экстрактов табака.
- Контроль температуры для индуцирования агрегации белков.
- Последующие методы хроматографической очистки.
- Демонстрация магистрантом в лабораторных условиях.
Основные результаты
- Более 90% HCP были удалены из экстрактов.
- Термическая обработка при температуре выше 60 °C эффективно приводила к агрегации растительных HCP.
- Метод прост в реализации и адаптируем.
- Метод облегчил очистку рекомбинантных белков.
Выводы
- Термическое осаждение является эффективным методом удаления HCP.
- Эта методика позволяет повысить эффективность процессов очистки белков.
- В дальнейших исследованиях может быть изучена возможность ее применения для других белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Загрязнение белками клеток-хозяев (HCP) остается критическим узким местом при очистке биофармацевтических препаратов, особенно в экспрессионных системах на основе растений, где высокая нагрузка HCP снижает эффективность хроматографии. В данном исследовании оцениваются три масштабируемых метода теплового осаждения — бланширование целых листьев табака, обработка в перемешивающем реакторе и обработка в теплообменнике — для селективной агрегации и удаления HCP при температурах выше 60°C, что позволяет улучшить результаты последующей очистки. Обеспечивая более высокую чистоту целевого белка перед хроматографией, эти подходы способствуют интенсификации процесса, снижают расход буферных растворов и повышают общую стабильность производства вакцин-кандидатов и терапевтических белков, полученных в растениях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает возможность функциональной оценки целевых белков за счет снижения влияния белков клетки-хозяина (HCP) в рабочих процессах очистки на ранних стадиях.
- Практическая ценность: предлагает быстрый этап осветления с использованием нагрева, совместимый с маломасштабным скринингом экспрессии в Nicotiana spp.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать осветленные экстракты с пониженным фоном белков клетки хозяина (HCP), что улучшает соотношение сигнал/шум в последующих иммуноанализах и измерениях активности.
- Практическая ценность: стандартизирует подготовку исходного материала для обеспечения стабильных результатов хроматографии в повторных сериях экспериментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает производство вакцин-кандидатов, таких как Vax8, с повышенной степенью чистоты, что облегчает оценку их иммуногенности и безопасности.
- Практическая ценность: Интегрируется в существующие процессы перфузионного или периодического сбора урожая без необходимости генетической модификации хозяина.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Термическое осаждение представляет собой стадию технологического процесса между сбором биомассы и хроматографией, которая применяется в рабочих процессах получения рекомбинантных белков из растений — от начальных этапов разработки до производства образцов для доклинических исследований.
- Биология открытий: Снижает уровень шума, вызванного белками клетки-хозяина (HCP), при детекции целевого белка, что способствует снижению механистических рисков при разработке терапевтических кандидатов.
- Скрининг: Повышает прозрачность и фильтруемость экстракта, обеспечивая надежный высокопроизводительный скрининг очистки.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели снижения уровня HCP (например, удаление 84–96%) и повышения чистоты (например, DsRed с 0,1% до 27,6%) для сравнения процессов.
- Трансляционные исследования: Сохраняет целостность целевого белка (например, Vax8, DsRed) после обработки, что обеспечивает преемственность при переходе к этапам формулирования и тестирования эффективности.
- Корпоративное повторное использование: Адаптируемо для различных систем экспрессии в растениях и целевых белков с минимальной ревалидацией, что поддерживает внедрение на уровне платформы.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение предсказуемости результатов очистки за счет стабильного удаления HCP и снижения загрязнения хроматографических колонок.
- Операционная ценность: Увеличение емкости фильтров глубинной очистки на стадиях выделения (до 2,5 раз в перемешиваемом сосуде) и снижение частоты замены буфера.
- Стратегическая ценность: Снижение производственных рисков за счет удаления технологических примесей на ранних этапах, что уменьшает вероятность брака партий на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию кандидатов растительного происхождения с учетом рисков за счет улучшения показателей разрабатываемости на ранних этапах.
Особенности реализации
- Требуется опыт в управлении термическими процессами и оценке стабильности белков во избежание денатурации целевого продукта.
- Зависит от наличия сосудов с регулируемой температурой, теплообменников или инфраструктуры для бланширования с возможностью точного перемешивания и мониторинга.
- Необходима стандартизация времени бланширования, температуры и геометрии сосудов на всех участках для воспроизводимого удаления HCP.
- Связано с компромиссами: бланширование может снизить емкость фильтра, в то время как использование теплообменников, несмотря на масштабируемость, создает сложности при очистке.
- Требуется эмпирическая оптимизация с помощью планирования экспериментов для достижения баланса между удалением HCP, выходом продукта и работоспособностью последующих этапов очистки для каждого целевого белка.
