Автоматизированный анализ C. Элеганс Плавать Поведение Использование CELEST программного обеспечения

Общая цель этой методологии заключается в количественной оценке поведения C.Elegans при плавании с использованием программного обеспечения компьютерного зрения под названием CeleST для C.Elegans Swim Test. Он также может легко оценить возрастное снижение мощностей локомотивов. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что можно одновременно отслеживать несколько животных, при этом различные аспекты позы при плавании анализируются для оценки восьми параметров поведения при плавании, а также автоматическая оценка данных.

Начните с приобретения стереомикроскопа и цифровой ПЗС-камеры, а также компьютера с программным обеспечением для цифровой видеозаписи и компьютерного зрения для анализа поведения C.Elegans при плавании. В программном обеспечении для цифровой видеозаписи установите следующие настройки:Накройте микроскоп темной тканью, чтобы предотвратить появление бликов в зоне плавательной капли на предметном стекле микроскопа и улучшить качество изображения. Отрегулируйте рабочее расстояние и увеличение микроскопа для полного обзора зоны плавания, а также отрегулируйте базовое зеркало, чтобы получить резкий контраст животных на фоне.

Затем установите освещение на темное поле, чтобы визуализировать тела взрослых особей белыми на черном фоне. Затем нанесите пипеткой 60 микролитров буфера 1 x M9 в 10-миллиметровое кольцо, предварительно напечатанное на предметном стекле микроскопа, и убедитесь, что капля полностью покрывает внутреннюю область кольца. Перенесите четырех взрослых нематод в каплю 1 x M9 буфера, минимизируя при этом транспортировку бактерий, которые могут помутнеть жидкость.

Сведите к минимуму количество бактерий в плавательном колодце, позволив нематодам ненадолго поползти по несидячей области пластины перед переносом, или слегка перемешав плавательный колодец, чтобы рассеять незначительные следы бактерий перед записью. Затем поместите предметное стекло со взрослыми нематодами на дно микроскопа, чтобы записать их поведение при плавании в жидкости в 30-секундных видеороликах. Для записи выберите «Новая последовательность в ОЗУ» под заголовком «Главная», затем нажмите красную кнопку записи.

Наконец, после завершения записи щелкните заголовок «Главная» и выберите «Экспортировать полную последовательность», чтобы разбить видео на последовательность кадров изображения. Начните с запуска программного обеспечения компьютерного зрения для анализа поведения при плавании C.elegans из Mat Lab, нажав кнопку «Запустить». На главном экране программы анализа заплывов используйте кнопки «Добавить одно видео» или «Добавить несколько видео», чтобы загрузить последовательности кадров изображений по одному или группами, прикрепив соответствующие метки, такие как генотип, дата, испытание и продолжительность.

Затем нажмите «Обрабатывать видео», чтобы включить одновременное отслеживание нескольких животных в загруженных последовательностях. В появившемся новом экране выберите нужные видео в левом поле и нажмите «Добавить в список»Далее разграничьте зону плавания, выбрав три точки внутри кольца и инициируйте обработку, нажав «Обработать все перечисленные выше видео». Следите за ходом обработки видео в центральной нижней части экрана.

После его завершения закройте экран обработки видео. Начните с нажатия кнопки «Вычислить меры», чтобы открыть новый экран, на который можно загружать обработанные видео по одному, чтобы подтвердить или отклонить отслеживание отдельных животных. Используйте этот ручной шаг, чтобы сосредоточиться на областях пропущенного отслеживания, показанных красными блоками, и контрастировать с успешным отслеживанием, отмеченных зелеными блоками.

Найдите значение "Срок действия сегментированного тела" на первой цветной полосе экрана в нижней половине. Обратите внимание, что процент допустимых кадров отмечен зеленым цветом, а процент отклоненных кадров — красным. Затем перемещайтесь и изменяйте блоки действительных или отклоненных кадров с помощью следующего блока, опций «Переключить валидность»Разделить блок» и «Изолировать кадр».

В редких случаях, когда два животных пересекаются в малолюдной зоне для купания, поменяйте их идентификационные номера в определенном диапазоне кадров с помощью кнопки «Switch». Наконец, нажмите «Сохранить и вычислить показатели», чтобы сохранить действительный ввод перед загрузкой еще одного обработанного видео. Затем выберите «Закрыть», чтобы выйти из экрана «Вычислительные показатели».

Обратите внимание, что программное обеспечение вычисляет карты кривизны плавательных характеристик отдельных животных на заднем плане, а также восемь параметров, указанных ниже. На главном экране программы компьютерного зрения нажмите кнопку «Показать результаты», чтобы получить результаты анализа. Затем создайте группы выборок для статистической обработки, выбрав нужные анализируемые последовательности кадров в левом поле и переместив их в новую существующую группу выборки, нажав кнопки «Добавить в выбранную выборку» или «Добавить в новую выборку».

Нажмите Показать графики для этих образцов», чтобы перейти на второй экран, на котором отображаются графики и ключевая статистика выборок для каждого из восьми параметров, выбранных в верхней части экрана. Затем выберите "2D гистограммы", чтобы построить комбинации любых двух параметров с помощью измерения на оси X и измерения на выпадающих меню по оси Y в левой части экрана. Нажмите «Закрыть», чтобы выйти и вернуться на экран «Отображение результатов».

Затем нажмите кнопку экспорта в верхнем левом углу экрана, чтобы сохранить подробные числовые данные в виде файла csv, который можно открыть и далее работать с ним в программе для работы с электронными таблицами. Наконец, выберите «Закрыть», чтобы выйти из экрана «Результаты отображения» и вернитесь на главный экран. Нажмите кнопку «Выйти», чтобы обеспечить сохранение базы данных, содержащей анализируемые видеофрагменты.

Некоторые параметры плавания, такие как скорость инициации волн, индекс активности, ход кисти и скорость передвижения, постепенно снижались с возрастом даже на благоприятном генетическом фоне. С другой стороны, число волн тела, асимметрия, растяжение и параметры скручивания имели тенденцию к росту с возрастом у взрослых особей дикого типа и стареющих мутантов. Хотя все нематоды начинают как здоровые взрослые особи, некоторые из них быстро теряют свою физическую форму, в то время как другие сохраняют бодрость в течение более длительных периодов времени, что указывает на то, что у плохих пожилых людей продолжительность здоровья значительно меньше, чем у грациозных.

После освоения анализ четырех плавательных червей может быть получен за считанные минуты. Вычисления занимают около шести минут на видео и могут быть выполнены удаленно. В сутки можно обрабатывать 250 животных.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получать видео плавательных испытаний, а также обрабатывать данные для получения оценки локомоции в жидкости.