Измеряя ферментативную активность лактазы в лаборатории обучения
6 августа 2018 г.
Ферментативная активность лактазы имеет важное значение для катаболических обработки дисахарид лактоза. Здесь активность лактазы в биологически активных добавок является анализ с использованием колориметрического анализа. Это обеспечивает студентов экспериментальной площадкой для понимания активность лактазы и фермента кинетики.
Этот метод является полезным инструментом для ознакомления студентов с концепциями, управляющими ферментативными реакциями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он подходит для студентов с очень небольшим опытом работы в мокрых лабораториях, обеспечивая надежные результаты для наблюдения и интерпретации. Чтобы начать протокол, нанесите этикетку на 15-миллилитровую суспензию в тюбике.
Одну таблетку лактазы, содержащую 200 мг фермента, измельчить в ровный порошок с помощью ступки и пестика. Поместите полученный порошок в помеченную пробирку и повторно суспендируйте его в 10 миллилитрах 100 миллимолярного фосфатного буферного раствора, или PBS. Ввергните раствор в течение одной минуты, чтобы максимизировать экстракцию фермента.
Затем перелейте один миллилитр из суспензии в пробирку объемом 1,5 миллилитра и вращайте образец в течение одной минуты при температуре 10 000 G для осаждения твердых частиц. Перенесите 500 микролитров надосадочной жидкости в чистую 1,5-миллилитровую тубу с меченым экстрактом лактазы. Поместите 390 микролитров 100 миллимолярных PBS в 1,5-миллилитровую пробирку с маркировкой реакции А. Затем добавьте 100 микролитров пятимиллимолярного раствора ONPG и хорошо перемешайте путем вортексирования.
Добавьте 10 микролитров экстракта в реакционную пробирку и перебейте содержимое. Часто наблюдайте за реакционной смесью в течение пяти минут и отмечайте любые колориметрические изменения раствора. Установите две пробирки по 1,5 миллилитров, одну меченую реакцию В, одну меченую контрольную.
Добавьте 390 микролитров 100 миллимолярных PBS в реакционную В-трубку, 400 микролитров 100 миллимолярных PBS в контрольную трубку, а затем добавьте по 100 микролитров пяти миллимолярных ONPG в каждую трубку. Перемешайте содержимое путем вортексинга. Добавьте 10 микролитров экстракта лактазы в реакционную В-пробирку, перемешайте вортексированием и дайте реакции протекать в течение одной минуты при комнатной температуре.
По прошествии одной минуты добавьте 500 микролитров одного молярного карбоната натрия в обе трубки, чтобы ингибировать фермент лактазу за счет повышения pH, останавливая реакцию. Перелейте 500 микролитров из каждой пробирки в чистые кюветы спектрофотометра и измерьте поглощение на 420 нанометрах. Установите три контрольные трубки и три реакционные трубки и пометьте их как четыре градуса Цельсия, комнатная температура, и 37 градусов Цельсия.
После добавления ферментного экстракта инкубируйте одну пробирку на льду, одну при комнатной температуре и одну при 37 градусах Цельсия на предварительно разогретой водяной бане в течение одной минуты. Затем остановите реакцию, добавив в каждую пробирку по 500 микролитров одного моляра карбоната натрия. Измерьте поглощение на 420 нанометрах для каждой трубки.
Запишите значения, в каждом случае вычитая контрольное значение из значения реакции. При использовании протокола контроль остается прозрачным, в то время как реакционный раствор, содержащий экстракт из таблетки лактазы, становится желтым по мере гидролиза ONPG, высвобождая ортонитрофенол. После анализа образцов с помощью спектрофотометра выработка ортонитрофенола является наименьшей при инкубации реакции на льду и самой высокой при проведении реакции при 37 градусах Цельсия.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что перед добавлением ферментного экстракта реакции должны протекать при соответствующей температуре.
Обзор
В данной статье представлена колориметрическая методика для измерения ферментативной активности лактazy, которая имеет решающее значение для переработки лактозы. Метод разработан для студентов с минимальным опытом работы в мокрой лаборатории, что позволяет им наблюдать и интерпретировать кинетику ферментов эффективно.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Кинетика ферментов
- Обучение лабораторным методам
Предисловие
- Лактаза - это фермент, который расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу.
- Понимание активности ферментов фундаментально в биохимии и смежных областях.
- Колориметрические анализы обеспечивают визуальное представление ферментативных реакций.
- Этот метод доступен для студентов с ограниченным опытом лабораторных исследований.
Цель исследования
- Ввести студентов в кинетику ферментов через практический эксперимент.
- Предоставить надежный метод измерения активности лактazy.
- Улучшить понимание факторов, влияющих на ферментативные реакции.
Используемые методы
- Приготовление экстракта лактazy из диетических добавок.
- Колориметрическое измерение образования орто-нитрофенола.
- Сравнение активности ферментов при различных температурах.
- Использование спектрофотометрии для измерения изменений в абсорбции.
Основные результаты
- Смесь реагентов становится желтого цвета, когда ОНПГ гидролизован лактазой.
- Активность фермента наиболее высока при 37 градусах Цельсия и наименьшая на льду.
- Контрольные образцы остаются прозрачными, что подтверждает специфичность анализа.
- Результаты демонстрируют влияние температуры на кинетику ферментов.
Выводы
- Колориметрический анализ эффективно иллюстрирует активность лактazy.
- Этот метод подходит для образовательных целей в биохимии.
- Понимание кинетики ферментов важно для будущих исследований в области метаболических процессов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This educational protocol demonstrates a foundational enzyme activity assay using lactase, a therapeutically relevant target in gastrointestinal disorders. The colorimetric method provides a scalable, reproducible approach for teaching enzyme kinetics principles applicable to early-stage target validation and assay development in biopharma R&D. By linking enzymatic function to a clinically significant substrate (ONPG), the assay supports mechanistic de-risking and predictive confidence in enzyme-targeted therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lactase enzyme function and substrate specificity, supporting target hypothesis testing in gastrointestinal disease models.
- Operational Value: Uses commercially available lactase from dietary supplements, offering a low-cost, accessible system for preliminary target engagement studies.
- Predictive Value: Quantitative absorbance measurements at 420 nm allow assessment of enzyme activity under varying conditions, informing structure-activity relationships and lead candidate screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: The ONPG-based colorimetric reaction produces a quantifiable yellow product (ortho-nitrophenol), enabling high-throughput compatible readouts for enzyme inhibition or activation screening.
- Reproducibility: Standardized extraction from tablets and controlled incubation conditions (ice, room temp, 37°C) ensure consistent results across replicates, supporting assay robustness.
- Scalability: Simple tube-based format with spectrophotometric detection allows adaptation to multi-well platforms for compound library screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Lactase deficiency is directly linked to lactose intolerance, making this assay a relevant tool for evaluating enzyme replacement therapies or dietary interventions.
- Translational Continuity: Temperature-dependent activity profiling (lowest on ice, highest at 37°C) mirrors physiological conditions, aiding in the prediction of in vivo enzyme behavior.
- Mechanistic De-risking: Clear differentiation between reaction and control tubes confirms assay specificity, reducing false-positive risks in downstream therapeutic validation.
Pipeline & Workflow Integration
The lactase activity assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through functional enzyme measurement and enabling assay development for screening campaigns focused on gastrointestinal targets.
- Discovery Biology: Measures lactase-mediated hydrolysis of ONPG to assess enzyme function, supporting biological de-risking of lactase as a therapeutic target.
- Screening: Produces quantitative, colorimetric outputs suitable for evaluating modulator effects in enzyme-focused screening workflows.
- Analytics: Spectrophotometric measurement at 420 nm provides objective data for comparing enzymatic activity across conditions, enabling data-driven hit selection.
- Translational Research: Links enzyme activity to lactose metabolism, connecting in vitro findings to clinical relevance in malabsorption disorders.
- Enterprise Reuse: Protocol uses standard lab equipment (vortex, centrifuge, spectrophotometer), facilitating broad adoption across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into enzyme-substrate interactions, enhancing target confidence and reducing ambiguity in early target validation.
- Operational Value: Employs robust, standardized steps (tablet extraction, centrifugation, temperature-controlled incubation) ensuring reproducibility and minimal variability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions by delivering clear, quantitative activity data that reduces reliance on indirect or surrogate markers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lactase-targeted interventions based on empirical activity profiles under physiologically relevant conditions.
Implementation Considerations
- Requires basic biochemical competencies in enzyme handling, spectrophotometry, and solution preparation.
- Depends on access to a spectrophotometer capable of absorbance measurement at 420 nm and a centrifuge for supernatant clarification.
- Necessitates standardization of extract preparation and reaction timing to ensure consistent results across users and batches.
- Adaptation to other enzymes may require substrate and buffer optimization, as ONPG specificity is limited to galactosidase activity.
- pH shift via sodium carbonate addition is critical for reaction termination; incomplete quenching may affect absorbance accuracy.
