Измеряя ферментативную активность лактазы в лаборатории обучения
6 августа 2018 г.
Ферментативная активность лактазы имеет важное значение для катаболических обработки дисахарид лактоза. Здесь активность лактазы в биологически активных добавок является анализ с использованием колориметрического анализа. Это обеспечивает студентов экспериментальной площадкой для понимания активность лактазы и фермента кинетики.
Этот метод является полезным инструментом для ознакомления студентов с концепциями, управляющими ферментативными реакциями. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он подходит для студентов с очень небольшим опытом работы в мокрых лабораториях, обеспечивая надежные результаты для наблюдения и интерпретации. Чтобы начать протокол, нанесите этикетку на 15-миллилитровую суспензию в тюбике.
Одну таблетку лактазы, содержащую 200 мг фермента, измельчить в ровный порошок с помощью ступки и пестика. Поместите полученный порошок в помеченную пробирку и повторно суспендируйте его в 10 миллилитрах 100 миллимолярного фосфатного буферного раствора, или PBS. Ввергните раствор в течение одной минуты, чтобы максимизировать экстракцию фермента.
Затем перелейте один миллилитр из суспензии в пробирку объемом 1,5 миллилитра и вращайте образец в течение одной минуты при температуре 10 000 G для осаждения твердых частиц. Перенесите 500 микролитров надосадочной жидкости в чистую 1,5-миллилитровую тубу с меченым экстрактом лактазы. Поместите 390 микролитров 100 миллимолярных PBS в 1,5-миллилитровую пробирку с маркировкой реакции А. Затем добавьте 100 микролитров пятимиллимолярного раствора ONPG и хорошо перемешайте путем вортексирования.
Добавьте 10 микролитров экстракта в реакционную пробирку и перебейте содержимое. Часто наблюдайте за реакционной смесью в течение пяти минут и отмечайте любые колориметрические изменения раствора. Установите две пробирки по 1,5 миллилитров, одну меченую реакцию В, одну меченую контрольную.
Добавьте 390 микролитров 100 миллимолярных PBS в реакционную В-трубку, 400 микролитров 100 миллимолярных PBS в контрольную трубку, а затем добавьте по 100 микролитров пяти миллимолярных ONPG в каждую трубку. Перемешайте содержимое путем вортексинга. Добавьте 10 микролитров экстракта лактазы в реакционную В-пробирку, перемешайте вортексированием и дайте реакции протекать в течение одной минуты при комнатной температуре.
По прошествии одной минуты добавьте 500 микролитров одного молярного карбоната натрия в обе трубки, чтобы ингибировать фермент лактазу за счет повышения pH, останавливая реакцию. Перелейте 500 микролитров из каждой пробирки в чистые кюветы спектрофотометра и измерьте поглощение на 420 нанометрах. Установите три контрольные трубки и три реакционные трубки и пометьте их как четыре градуса Цельсия, комнатная температура, и 37 градусов Цельсия.
После добавления ферментного экстракта инкубируйте одну пробирку на льду, одну при комнатной температуре и одну при 37 градусах Цельсия на предварительно разогретой водяной бане в течение одной минуты. Затем остановите реакцию, добавив в каждую пробирку по 500 микролитров одного моляра карбоната натрия. Измерьте поглощение на 420 нанометрах для каждой трубки.
Запишите значения, в каждом случае вычитая контрольное значение из значения реакции. При использовании протокола контроль остается прозрачным, в то время как реакционный раствор, содержащий экстракт из таблетки лактазы, становится желтым по мере гидролиза ONPG, высвобождая ортонитрофенол. После анализа образцов с помощью спектрофотометра выработка ортонитрофенола является наименьшей при инкубации реакции на льду и самой высокой при проведении реакции при 37 градусах Цельсия.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что перед добавлением ферментного экстракта реакции должны протекать при соответствующей температуре.
Обзор
В данной статье представлен колориметрический метод определения ферментативной активности лактазы, которая играет ключевую роль в переваривании лактозы. Метод разработан для студентов с минимальным опытом работы в лаборатории, что позволяет им эффективно наблюдать за кинетикой ферментов и интерпретировать полученные результаты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Кинетика ферментов
- Обучение лабораторным методам
Теоретические основы
- Лактаза — это фермент, который расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу.
- Понимание активности ферментов имеет фундаментальное значение в биохимии и смежных областях.
- Колориметрический анализ обеспечивает визуальное представление ферментативных реакций.
- Данный метод доступен для студентов с ограниченным опытом лабораторной работы.
Цель исследования
- Познакомить студентов с кинетикой ферментов с помощью практического эксперимента.
- Предоставить надежный метод измерения активности лактазы.
- Углубить понимание факторов, влияющих на ферментативные реакции.
Используемые методы
- Приготовление экстракта лактазы из пищевых добавок.
- Колориметрическое измерение продукции орто-нитрофенола.
- Сравнение активности фермента при различных температурах.
- Использование спектрофотометрии для количественного определения изменений абсорбции.
Основные результаты
- Реакционная смесь окрашивается в желтый цвет по мере гидролиза ONPG лактазой.
- Активность фермента максимальна при 37 °C и минимальна на льду.
- Контрольные образцы остаются прозрачными, что подтверждает специфичность анализа.
- Результаты демонстрируют влияние температуры на кинетику ферментативных реакций.
Выводы
- Колориметрический анализ эффективно иллюстрирует активность лактазы.
- Данный метод подходит для образовательных целей в области биохимии.
- Понимание кинетики ферментов имеет важное значение для дальнейшего изучения метаболических процессов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
В данном образовательном протоколе представлен базовый метод анализа активности фермента с использованием лактазы — терапевтически значимой мишени при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Колориметрический метод обеспечивает масштабируемый и воспроизводимый подход к преподаванию принципов кинетики ферментов, которые применимы при валидации мишеней на ранних этапах и разработке анализов в биофармацевтических исследованиях и разработках (R&D). Связывая ферментативную функцию с клинически значимым субстратом (ONPG), данный анализ способствует механистическому снижению рисков и повышению прогностической уверенности в стратегиях терапии, направленной на конкретные ферменты.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию фермента лактазы и его субстратную специфичность, что способствует проверке целевых гипотез в моделях заболеваний желудочно-кишечного тракта.
- Практическая ценность: использование коммерчески доступной лактазы из пищевых добавок обеспечивает недорогой и доступный метод для предварительных исследований взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: количественные измерения абсорбции при 420 nm позволяют оценить активность фермента при различных условиях, что дает информацию о взаимосвязях «структура — активность» и помогает в скрининге перспективных кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Колориметрическая реакция на основе ONPG приводит к образованию количественно определяемого желтого продукта (орто-нитрофенола), что позволяет проводить высокопроизводительный анализ для скрининга ингибирования или активации ферментов.
- Воспроизводимость: Стандартизированная экстракция из таблеток и контролируемые условия инкубации (на льду, при комнатной температуре, при 37°C) обеспечивают стабильные результаты в повторностях, что подтверждает надежность анализа.
- Масштабируемость: Простой формат с использованием пробирок и спектрофотометрическим детектированием позволяет адаптировать метод для многолуночных платформ при скрининге библиотек соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для медицины: Дефицит лактазы напрямую связан с непереносимостью лактозы, что делает данный анализ подходящим инструментом для оценки эффективности заместительной ферментной терапии или диетических вмешательств.
- Трансляционная преемственность: Профилирование активности в зависимости от температуры (минимум на льду, максимум при 37°C) отражает физиологические условия, что помогает прогнозировать поведение фермента in vivo.
- Снижение механических рисков: Четкое различие между реакционными и контрольными пробирками подтверждает специфичность анализа, снижая риск получения ложноположительных результатов при последующей терапевтической валидации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод анализа активности лактазы относится к этапу раннего поиска лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишени посредством функционального измерения активности фермента и позволяя разрабатывать аналитические системы для скрининговых кампаний, направленных на мишени желудочно-кишечного тракта.
- Биология открытий: Измерение лактаза-опосредованного гидролиза ONPG для оценки функции фермента, что способствует биологическому снижению рисков при использовании лактазы в качестве терапевтической мишени.
- Скрининг: Обеспечение количественных колориметрических результатов, подходящих для оценки эффектов модуляторов в рабочих процессах скрининга, ориентированного на ферменты.
- Аналитика: Спектрофотометрическое измерение при 420 nm предоставляет объективные данные для сравнения ферментативной активности в различных условиях, что позволяет осуществлять выбор хитов на основе данных.
- Трансляционные исследования: Связь активности фермента с метаболизмом лактозы, объединяющая результаты in vitro с клинической значимостью при расстройствах мальабсорбции.
- Корпоративное повторное использование: Протокол использует стандартное лабораторное оборудование (вортекс, центрифугу, спектрофотометр), что способствует широкому внедрению в командах по поиску новых лекарств и доклиническим исследованиям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов взаимодействия фермента с субстратом, повышая уверенность в выборе мишени и снижая неопределенность на ранних этапах валидации мишеней.
- Операционная ценность: использует надежные стандартизированные этапы (экстракция из таблетки, центрифугирование, инкубация при контролируемой температуре), что гарантирует воспроизводимость и минимальную вариабельность.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя четкие количественные данные об активности, что снижает зависимость от косвенных или суррогатных маркеров.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию вмешательств, нацеленных на лактазу, с учетом рисков на основе эмпирических профилей активности в физиологически релевантных условиях.
Особенности реализации
- Требуются базовые биохимические навыки работы с ферментами, проведения спектрофотометрии и приготовления растворов.
- Необходим доступ к спектрофотометру, способному измерять оптическую плотность при 420 nm, и к центрифуге для осветления супернатанта.
- Требуется стандартизация подготовки экстракта и времени проведения реакции для обеспечения воспроизводимости результатов между различными пользователями и партиями.
- Адаптация метода для других ферментов может потребовать оптимизации субстрата и буфера, так как специфичность ONPG ограничена галактозидазной активностью.
- Смещение pH путем добавления карбоната натрия имеет решающее значение для прекращения реакции; неполное гашение может повлиять на точность измерения оптической плотности.
