Анионной полимеризации амфифильного Сополимер по подготовке блоксополимера мицелл, стабилизированных π-л стэкинг-взаимодействий

Общая цель данной работы — продемонстрировать критические этапы, необходимые для синтеза блок-сополимерных материалов методом анионной полимеризации с раскрытием кольца, а также показать необходимую последовательность исследований для создания мицелл блок-сополимеров для доставки гидрофобного лекарственного препарата. В данном протоколе показано правильное выполнение необходимых шагов и процедур для синтеза блок-сополимера путем анионной полимеризации. Основным преимуществом анионной полимеризации с раскрытием кольца является синтез материалов с высоким выходом и низким индексом полидисперсности.

А также масштабируемость процесса. Сейчас наступил многообещающий период для полимерных систем доставки лекарств, поскольку ряд препаратов на основе специальных рецептур и мицелл блок-сополимеров в настоящее время находится на поздних стадиях доклинических или клинических исследований.

Подготовьте реагенты и материалы для переноса согласно текстовому протоколу. Взвесьте метоксиполиэтиленгликоль с молекулярной массой 5 000. Добавьте mPEG в сухую колбу с магнитным перемешивателем и закройте адаптер для продувки септой сверху.

Подсоедините колбу к многообразному коллектору и продуйте её аргоном в течение двух-трех минут. Переведите вентиль в положение «вакуум», чтобы создать разрежение в колбе. Вращайте колбу вручную и равномерно просушите реакционный сосуд с помощью фена или строительного фена до расплавления mPEG.

Через одну минуту сбросьте вакуум, повернув вентиль на коллекторе в положение Argon несколькими быстрыми движениями, чтобы охладить колбу. Выдержите полимерный макроинициатор под вакуумом примерно два часа, а затем в атмосфере Argon до начала реакции. Далее установите два аппарата для дистилляции в высоком вакууме, которые предварительно были высушены в печи под вытяжкой.

Одна установка предназначена для дистилляции DMSO, а другая — для дистилляции мономера, фенилглицерилового эфира. Подсоедините соответствующие колбы к обеим установкам и установите каждую из них на полусферический нагревательный кожух или в масляную баню. Подведите холодную воду к верхней части каждой установки и к коллектору.

Убедитесь, что все части аппаратуры надежно закреплены и герметичны. Откройте вакуум с помощью клапана. Установите температуру нагрева с помощью контроллера и начните перемешивание растворов.

После двух часов циркуляционной перегонки DMSO закройте клапан высокого вакуума, чтобы собрать примерно 20 миллилитров раствора. Затем слейте эту фракцию в колбу и повторите операцию еще раз, чтобы обеспечить чистоту требуемой фракции, которая будет собрана позже. Нагревайте колбу с mPEG под вакуумом с помощью тепловой пушки до расплавления полимера, а затем снова продуйте систему аргоном.

Через два часа закройте клапан высокого вакуума и соберите объем растворителя. Прекратите нагрев и снимите вакуум с коллектора. Заполните камеру аргоном, как было описано ранее.

При положительном давлении аргона соедините один конец канюли с мерным цилиндром или непосредственно с колбой, содержащей mPEG (также в атмосфере аргона), и осторожно погрузите другой конец в свежеперегнанную фракцию. Подключите к колбе дополнительный барботер, перекройте подачу аргона и используйте только давление аргона из дистилляционного аппарата. Чтобы избежать несчастных случаев, вызванных давлением аргона, откройте стеклянный кран на одну-две секунды, затем снова закройте его и продолжайте перенос DMSO до полного завершения процесса.

Затем в атмосфере аргона соедините один конец канюли от высушенного мерного цилиндра, закрытого септой, с основным раствором 0.3 M нафталида калия. После этого добавьте дополнительный барботер в мерный цилиндр, перекройте подачу аргона в цилиндр и при положительном давлении аргона перенесите с помощью канюляции пять миллилитров 0.3 M нафталида калия из основного раствора в мерный цилиндр. Введите в цилиндр еще одну иглу из манифольда и удалите дополнительный барботер.

Осторожно извлеките канюлю, подсоединенную к исходному раствору, быстро вставьте ее в реакционную колбу и подключите дополнительный барботер. Затем, как было описано ранее, по каплям добавляйте основание до тех пор, пока раствор не станет темным. После медленного исчезновения окраски добавьте еще одну порцию, пока темный цвет не появится снова, и повторяйте эту процедуру до полного переноса.

Как было описано ранее, перенесите в реакционную смесь необходимый объем мономера для достижения степени полимеризации полифенолгликолевого эфира примерно от 18 до 20 звеньев. Оставьте реакционную смесь на 48 часов при 80 °C в атмосфере аргона при постоянном перемешивании для обеспечения полной полимеризации. Остановите реакцию, добавив по каплям 1 н. раствор соляной кислоты и метанол до исчезновения окраски.

Экстрагируйте нафталин из раствора ДМСО гексаном. Удалите примерно 70 миллилитров ДМСО путем дистилляции под вакуумом. Охладите суспензионный раствор и добавьте 15 миллилитров ТГФ.

Удалите соль из суспензии путем центрифугирования при 5 000 ×g в течение десяти минут. Перенесите супернатант и добавьте его по каплям к 500 миллилитрам холодного диэтилового эфира. Соберите осадок путем фильтрации или центрифугирования.

После двукратного повторения осаждения высушите осадок при комнатной температуре в вытяжном шкафу в течение ночи, а затем в вакууме при 30 °C от 24 до 48 часов, чтобы получить выход 85%. Теперь сополимер готов к определению характеристик, как описано в текстовом протоколе. Растворите 12 mg доксорубицина в 1 mL ацетонитрила. Добавьте 10 µL триэтиламина и перемешивайте раствор в темноте в течение двух часов.

Растворите 45 мг сополимера в 1 мл ТГФ и перемешивайте в течение того же промежутка времени. Добавьте раствор сополимера к раствору доксорубицина и промойте флакон с остатками сополимера дополнительным объемом ТГФ. Затем по каплям добавьте смесь сополимера с препаратом во флакон объемом 20 мл, содержащий 15 мл 0,9% физиологического раствора, при перемешивании.

Перенесите раствор в диализный мешок и проведите диализ против 500 миллилитров 0,9% физиологического раствора. Перенесите диализат в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 5 000 ×g в течение 15 минут. Затем перенесите супернатант в систему ультрафильтрации, содержащую диализную мембрану.

Поместите адаптер для перемешивания в систему ультрафильтрации, закройте крышку и откройте поток азота. Концентрируйте раствор мицелл блок-сополимера до объема четырех миллилитров и добавьте шесть миллилитров свежего физиологического раствора. Затем снова сконцентрируйте раствор мицелл блок-сополимера до 4 миллилитров, промойте камеру 0,5 миллилитрами физиологического раствора и добавьте его к раствору.

Храните полученный раствор в коричневых флаконах при комнатной температуре в темноте до дальнейшего использования. Для получения амфифильного диблок-сополимера использовали анионную полимеризацию с раскрытием кольца фенилглицеринового эфира на макроинициаторе mPEG путем глубокого протонирования гидроксильной группы mPEG. В качестве радикального аниона использовали калийный нафталенид с последующей полимеризацией мономера фенилглицеринового эфира.

Характеристика блок-сополимера с помощью гель-проникающей хроматографии и анализа методом протонного ЯМР подтвердила узкое молекулярно-массовое распределение со степенью полимеризации фенилглицерилового эфира, равной 15 единицам. В водной среде амфифильные блок-сополимеры собираются в мицеллы, состоящие из гидрофобного ядра, окруженного гидрофильной оболочкой. Просвечивающая электронная микроскопия подтвердила сферическую морфологию, а метод динамического рассеяния света показал гидродинамический диаметр 25 nm.

Доксорубицин был успешно инкапсулирован в мицеллы блок-сополимера. По сравнению со свободным протонированным препаратом в растворе, самогашение флуоресценции доксорубицина, наблюдаемое при флуоресцентной спектроскопии, подтвердило включение препарата в полимерные мицеллы, при этом эффективность загрузки препарата достигала 14%. Профиль высвобождения доксорубицина из мицелл блок-сополимера указал на хорошую стабильность данной формуляции при нейтральном pH, а также на пролонгированное высвобождение препарата в течение четырех дней в физиологически релевантных условиях.

После освоения эта методика поможет стажерам в области фармацевтических наук подготовить синтез диблок-сополимеров для применения в системах доставки лекарств. Описанная здесь процедура может быть использована для синтеза широкого спектра сополимеров с ПЭГ в качестве инициатора. Особое внимание уделено соблюдению надлежащей лабораторной практики для обеспечения безводных условий и получения высококачественных материалов.

После просмотра этого видео я должен хорошо понимать принципы работы в безводных условиях и смочь применить эти этапы для синтеза ПЭГ-полиэфиров или материалов на основе ПЭГ-полиэфиров. При проведении любого из описанных исследований крайне важно помнить, что работа осуществляется в контролируемых условиях с использованием потенциально опасных органических растворителей и других реагентов. Кроме того, все лекарственные препараты токсичны, и при работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности.

Например, использование перчаток, лабораторного халата, закрытой обуви, а также маски при взвешивании препаратов.