Работа с Слуховой HEI-OC1 клеток

Общая цель данного протокола заключается в описании основных процедур работы с клетками HEI-OC1, которые могут быть использованы для изучения влияния фармакологических препаратов на слуховые клетки, а также помочь в функциональной характеристике моторного белка престина. Клетки HEI-OC1 используются многими исследователями по всему миру в различных экспериментах с разными целями и с использованием разных методов. Хотелось бы надеяться, что описанные здесь процедуры обеспечат общую основу для обеспечения сопоставимости этих исследований.

Конечно, эти экспериментальные процедуры могут быть усовершенствованы в дальнейшем. Но различия с описанными здесь могут быть ключом к пониманию и объяснению возможных противоречивых результатов. В этой демонстрации мы расскажем, как работать с клетками HEI-OC1, начиная с замороженной аликвоты и заканчивая готовыми образцами для проведения различных исследований с помощью широко доступных технологий.

Чтобы начать эту процедуру, извлеките флакон с криоконсервированными клетками HEI-OC1 из жидкого азота и поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Погрузите в флакон только нижнюю половину флакона и дайте ему оттаять, пока в флаконе останется лишь небольшое количество льда. В шкафу биологической безопасности протрите флакон снаружи 70%-ным спиртом.

Затем пипеткой выведите клетки из флакона и медленно подайте весь объем по капле в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 10 миллилитров предварительно подогретой питательной среды, такой как DMEM, с добавлением 10% FBS. Затем извлеките ДМСО, центрифугируя пробирку в течение пяти минут. Через пять минут выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в девяти миллилитрах свежей питательной среды.

Дезагрегируйте комки или листы клеток путем флюсирования и рефлюксинга взвешенных клеток между пипеткой и средой три-четыре раза, при этом кончик пипетки касается дна пробирки. Затем поместите весь объем клеток, взвешенных в питательной среде, в необработанную пластиковую чашку для культивирования клеток диаметром 100 миллиметров. Инкубируйте клетки при температуре 33 градуса Цельсия с 10% CO2.

На этом этапе удалите старую среду и промойте клетки двумя миллилитрами PBS. Затем покройте монослой клетки 0,25% трипсина. Исследуйте клетки с помощью инвертированного микроскопа, когда 40% из них были отделены.

При необходимости осторожно покачивайте чашку для культивирования, чтобы освободить оставшиеся прикрепленные клетки Повторно суспендируйте клетки и удалите трипсин, центрифугируя пробирку в течение пяти минут. После этого выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в девяти миллилитрах свежей питательной среды. Затем разобьйте комки или листы клеток путем флюсирования и рефлюксирования взвешенных клеток между пипеткой и средой три-четыре раза, при этом кончик пипетки касается дна пробирки.

Приступайте к посеву клеток в чашки для клеточных культур диаметром 100 миллиметров. Инкубируйте их при температуре 33 градуса Цельсия с 10% CO2 и делите столько раз, сколько необходимо для запланированных экспериментов или для создания нового запаса. Для дифференцировки инкубируйте клетки HEI-OC1 в разрешающих условиях до тех пор, пока они не достигнут примерно 80% конфлюенции.

Затем инкубируйте клетки при температуре 39 градусов Цельсия с 5% CO2 в течение двух-трех недель и меняйте среду через день, чтобы удалить мертвые клетки. Начните эту процедуру с подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра и отрегулируйте концентрацию клеток до необходимого значения. Затем засейте клетки в 96-луночную плоскую пластину с плоским дном, 96-луночную пластину с белыми стенками или шестилуночную пластину.

Если этого требует конкретный анализ, инкубируйте клетки в течение ночи для прикрепления субстрата перед обработкой их представляющими интерес препаратами. Затем измерьте результат лечения с помощью проточной цитометрии или другого подходящего метода. Чтобы собрать клетки, дважды промойте их 10 миллилитрами PBS, не содержащего кальция и магния.

Добавьте два миллилитра раствора без ферментов и инкубируйте клетки в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2. Используйте инвертированный микроскоп, чтобы проверить отслоение клеток. При необходимости осторожно перемещайте чашку для клеточной культуры, чтобы отделить больше клеток, и будьте осторожны, чтобы не встряхнуть ее.

Затем добавьте 10 миллилитров DMEM плюс 10% FBS и осторожно пять раз проведите пипеткой клетки вверх и вниз. После этого посмотрите на клетки под микроскопом. Если более 80% клеток уже разделены, дальнейшее пипетирование не требуется.

Если клетки все еще находятся в кластерах, продолжайте осторожное пипетирование до тех пор, пока более 80% клеток не перестанут быть в кластерах. Оптический контроль клеток должен показать множество одиночных круглых клеток с гладкими краями мембраны. После этого продолжайте измерения патч-хомута и NLC, как описано в текстовом протоколе.

Клетки HEI-OC1, культивируемые в непермиссивных условиях, показали весьма значительное снижение жизнеспособности клеток и столь же значительное увеличение гибели клеток по сравнению с клеточными культурами в разрешающих условиях. Поскольку эффекты препарата на клетки, уже умирающие или обладающие сниженной жизнеспособностью, могут отличаться от эффектов того же препарата на здоровые клетки, в любом исследовании цитотоксичности, проведенном на клетках NP-HEI-OC1, следует приложить значительные усилия для различения эффектов препарата от эффектов условий культивирования. Поэтому мы рекомендуем использовать клетки HEI-OC1, культивируемые в разрешительных условиях, для экспериментов, не требующих специфически дифференцированных клеток.

Представленные здесь конфокальные изображения подтверждают экспрессию слухового моторного белка престина в клетках HEI-OC1, культивируемых при 33 градусах Цельсия и 39 градусах Цельсия. Следует отметить, что престин иммунолокализуется преимущественно в цитоплазме клеток HEI-OC1, растущих в разрешающих условиях, и более концентрируется на плазматической мембране в более дифференцированных клетках. Исследования проточной цитометрии показали явное увеличение экспрессии престина в обоих состояниях, что позволяет предположить, что транслокация сопровождалась синтезом большего количества молекул престина.

С другой стороны, электрофизиологические исследования показали устойчивый NLC в клетках HEI-OC1, растущий при 33 градусах Цельсия, с пиковым значением, которое уменьшалось, и напряжением на пиковой емкости, которое смещалось к более деполяризованным значениям при переводе клеток в неразрешающие условия на одну и две недели. Интересно, что эти результаты свидетельствуют о том, что двигательная функция может быть нарушена, если плотность молекул престина в плазматической мембране слишком высока. Важно помнить, что описанные здесь протоколы требуют правильного использования хорошо зарекомендовавших себя методик культивирования клеток.

Кроме того, не забывайте избегать использования антибиотиков. Кроме того, следует помнить, что фенотип и реакция клеток HEI-OC1 будут сильно зависеть от параметров культуры.