Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

Общая цель данной процедуры заключается в определении частоты нейральных стволовых клеток в заданной популяции с помощью формирования нейросфер и их дифференцировки в клональных условиях. Этот метод имеет ключевое значение в области изучения нейральных стволовых клеток, в частности, для оценки потенциальных маркеров нейральных стволовых клеток, их очистки, а также для дифференциации нейральных стволовых клеток от нейральных прогениторов. Преимуществами данного метода являются сокращенный срок выполнения (13 дней) по сравнению с существующими методами подсчета частоты нейральных стволовых клеток, а также проведение анализа в клональных условиях.

Для начала данной процедуры в первый день приготовьте среду для роста НСК, смешав среду DMEM F12 с B27, EGF, BFGF и пенициллином-стрептомицином. Затем диссоциируйте нейросферы мыши на стадии E14.5 в 1 мл среды для роста НСК и 1 мл 0,05 N гидроксида натрия в течение семи минут при комнатной температуре. Время от времени перемешивайте клетки пипетированием для поддержания их в суспензии, после чего добавьте 1 мл 0,05 N соляной кислоты для нейтрализации щелочи.

После этого проведите подсчет клеток с использованием окрашивания трипановым синим и гемоцитометра. Затем высейте единичные клетки нейросфер мыши стадии E14.5 с плотностью 50 клеток на миллилитр или ниже в 100 мкл среды для роста NSC в 96-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение одной недели для формирования клональных нейросфер.

Для культивирования нейросфер с целью получения кондиционированной среды на третий день диссоциируйте нейросферы мыши E14.5 и посейте отдельные клетки с плотностью 20 000 клеток на миллилитр в 10 миллилитрах ростовой среды для NSC в чашке для культивирования диаметром 10 сантиметров. Затем инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2 в течение пяти дней для получения массивных культур нейросфер. На восьмой день приготовьте раствор для покрытия, смешав 700 мкл 0,01% поли-L-лизина, 70 мкл ламинина в концентрации 1 мг/мл и 6 230 мкл PBS.

Затем покройте чашку для культивирования диаметром 10 сантиметров семью миллилитрами раствора поли-L-лизина и ламинина; выдержите в течение двух часов при 37 °C. С помощью серологической пипетки на 10 миллилитров перенесите все культивируемые нейросферы в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллиметров. Центрифугируйте нейросферы при 171 ×g в течение одной минуты при комнатной температуре, затем полностью удалите супернатант.

После этого приготовьте среду для дифференцировки NSC, смешав среду DMEM F12 с B27 и FBS. Добавьте 10 миллилитров среды для дифференцировки NSC к нейросферам и несколько раз перемешайте содержимое с помощью пипетки для ресуспендирования нейросфер. Затем удалите поли-L-лизин-ламинин из 10-сантиметровой культуральной чашки и один раз промойте ее 10 миллилитрами PBS.

Перенесите все нейросферы в 10-сантиметровую культуральную чашку, покрытую поли-L-лизин-ламинином, и инкубируйте их в течение ночи при 37 °C, 5% CO2 для прикрепления нейросфер к поверхности чашки. На восьмой день подсчитайте под микроскопом количество нейросфер, образовавшихся в каждой лунке, затем покройте каждую лунку 50-луночного планшета с покровными стеклами 10 µL раствора для покрытия поли-L-лизин-ламинином на два часа при 37 °C. Затем подготовьте три конических центрифужных пробирки объемом 50 mL, содержащие по 30 mL PBS в каждой.

С помощью стерильного пинцета извлеките покрытое покровное стекло с камерами на 50 лунок, погрузите его последовательно в первую, вторую, а затем в третью пробирку с PBS, чтобы смыть раствор для покрытия. После этого аспирируйте остатки жидкости из лунок покровного стекла. Осторожно перенесите всю среду и нейросферы из каждой лунки 96-луночного планшета в одну чашку для культивирования диаметром 10 сантиметров.

Чтобы каждый раз захватывать только одну нейросферу, установите объем дозатора на два микролитра; под микроскопом отберите образец нейросферы с помощью микропипетки P10 с наконечником объемом 10 мкл. Отбор нейросфер можно проводить под микроскопом, в ламинарном шкафу или на лабораторном столе. Затем перенесите нейросферу в центр лунки многолуночного покровного стекла (50 лунок) с нанесенным покрытием.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока в каждой лунке камерного покровного стекла не окажется нейросфера. Затем добавьте в каждую лунку камерного покровного стекла по 10 µL среды для дифференцировки NSC. Поместите камерное покровное стекло в чашку для культивирования диаметром 10 cm.

В чашку диаметром 10 сантиметров можно поместить до двух камерных покровных стекол. Пипетируйте PBS вдоль краев чашки, чтобы предотвратить высыхание среды для дифференцировки NSC. Инкубируйте камерное покровное стекло в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.

На девятый день перенесите кондиционированную среду из чашки с культивируемыми нейросферами в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. С помощью стерильного шприца объемом 20 мл пропустите кондиционированную среду через фильтр с порами 0,2 мкм для удаления клеток или клеточного детрита. Затем перенесите отфильтрованную кондиционированную среду обратно в чашку для культивирования диаметром 10 см.

После этого с помощью стерильного пинцета осторожно поместите покровное стекло с камерой в кондиционированную среду перевернутым образом, чтобы нейросферы образца были направлены вниз. Инкубируйте покровное стекло с камерой в течение трех дней при 37 °C и 5% CO2. На 12-й день осторожно извлеките покровное стекло с камерой из 10 сантиметровой культуральной чашки с помощью стерильного пинцета.

Осторожно погрузите покровное стекло в PBS, чтобы смыть кондиционированную среду. Затем аккуратно и медленно отделите силиконовую прокладку от покровного стекла, чтобы не разбить его. Запомните, с какой стороны прикреплены дифференцированные нейросферы.

После этого перенесите 1 мл 4% параформальдегида на фрагмент парафиновой пленки, вырезанный по размеру покровного стекла. Осторожно поместите покровное стекло на парафиновую пленку так, чтобы нейросферы были обращены вниз и соприкасались с параформальдегидом, и зафиксируйте нейросферы в течение 20 минут при комнатной температуре. В данном случае отдельные нейросферы отбирали и дифференцировали в 50-луночном камерном покровном стекле в течение трех дней.

На данном изображении представлена типичная трипотентная нейросфера, окрашенная DAPI и иммуноокрашенная на GFAP, TUJ1 и O4. На данном изображении показано совмещение сигналов DAPI, GFAP, TUJ1 и O4. Данный протокол используется для оценки способности LeX, известного маркера НСК, обогащать популяцию НСК. На этом графике показан процент унипотентных, бипотентных и трипотентных нейросфер, полученных из LeX-положительных и LeX-отрицательных клеток. LeX-положительные клетки образуют значительно больше трипотентных нейросфер, чем LeX-отрицательные.

В этой таблице показано, что частота НСК для LeX-положительных и LeX-отрицательных клеток рассчитывалась как произведение NFU и процента трипотентных нейросфер. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как можно культивировать и дифференцировать нейросферы в клональных условиях для определения частоты нейральных стволовых клеток. При выполнении данного метода важно использовать свежеприготовленные среды для роста и дифференцировки, а также свежеприготовленный раствор для покрытия, чтобы обеспечить оптимальные условия роста и дифференцировки нейросфер.

После освоения данный метод может быть выполнен за 13 дней, что является более коротким сроком по сравнению с существующими методами подсчета частоты нейральных стволовых клеток. Этот метод может использоваться в сочетании с текущими методами, такими как анализ нейральных колониеобразующих клеток, для обогащения выборки новыми стволовыми клетками и идентификации определенного маркера нейральных стволовых клеток.