Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из Кишечная палочка: Проектирование, производство и очистка

Общая цель этой процедуры заключается в очистке и описании заполненных ферментами бактериальных внешних мембранных везикул для использования в качестве каталитических реагентов in vitro. Этот метод выделения ферментов позволяет собирать бактериальные OMV из питательных сред, а затем использовать их для проведения бесклеточного катализа фосфорорганического соединения. Направленная упаковка в бактериальных OMV значительно улучшает стабильность ферментов в различных реакциях и условиях хранения, в отличие от традиционных методов, которые часто приводят к постепенной и непрерывной потере активности ферментов.

Применение этого метода распространяется на упаковку белков, имеющих значение во многих областях, таких как разработка терапевтических средств, восстановление или разработка внеклеточных каталитических систем. В то время как в этом протоколе подробно описывается очистка OMV из E.coli, методы с модификацией стратегии упаковки могут быть легко использованы для очистки OMV из различных культур микробных клеток. После создания везикул внешней мембраны или OMV у бактерий в соответствии с текстовым протоколом центрифугируйте неповрежденную бактериальную культуральную среду при температуре 7000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Удалите и сохраните надосадочную жидкость, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Затем пропустите надосадочную жидкость через второй отжим, чтобы убедиться, что все бактерии удалены из среды. Чтобы удалить белковые агрегаты и крупный клеточный материал из сохраненной питательной среды, наберите раствор в стерильный шприц объемом от 10 до 50 миллилитров.

Прикрепите фильтр 0,45 микрона, чтобы приманить конец шприца. Затем нажмите на поршень и соберите проточный поток в новую трубку. В качестве альтернативы можно вакуумировать питательную среду, переместив ее в стерильный фильтрующий аппарат.

Прикрепите устройство к вакуумному насосу или аспиратору раковины для создания всасывания. Перелейте отфильтрованную среду в новую емкость. Чтобы изолировать OMV, переведите отфильтрованную питательную среду в ультрацентрифугирующие пробирки.

Вращайте среду при температуре приблизительно 150 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение трех часов с помощью ротора, соответствующего используемым трубкам. Сразу после ультрацентрифугирования, чтобы избежать потери массы гранул, сцедите обедненную OMV питательную среду из слегка коричневой гранулы OMV, которая может быть видна или не видна на глаз. Гранулы OMV, сформированные после ультрацентрифугирования, могут быть только слабо приклеены к центрифугирующему пузырю.

При сцеживании следует соблюдать осторожность, чтобы гранулы не сместились и не потерялись. Сохраните надосадочную жидкость для последующего динамического рассеяния света, чтобы убедиться, что частицы OMV полностью исчерпаны из среды. Добавьте в гранулу от 0,5 до одного миллилитра стерильного фильтрованного PBS, PH 7,4 или другого отфильтрованного буфера, как это определено экспериментальными потребностями или условиями, и дайте ей инкубироваться при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем осторожно пипетируйте очищенный раствор OMV, осторожно перемешивая, чтобы убедиться, что вся гранула растворилась. Чтобы определить распределение OMV по размерам, откройте программное обеспечение DLS для отслеживания наночастиц для используемого прибора. Включите микроскоп и очистите все поверхности микроскопа и устройства слежения за наночастицами.

С помощью стерильного шприца объемом в один миллилитр добавьте примерно 0,5 миллилитра образца OMV непосредственно в смотровое окно устройства слежения за частицами через нижний фитинг, стараясь закрыть все смотровое окно без впрыскивания пузырьков воздуха в систему. Поместите блок слежения за наночастицами на предметный столик микроскопа и включите лазер. Затем нажмите «Захват» в программном обеспечении.

Отрегулируйте фокус и столик микроскопа, чтобы визуализировать частицы на экране предварительного просмотра, присутствующем в окне программного обеспечения. Отрегулируйте затвор камеры и усиление камеры до тех пор, пока яркие частицы не станут четко визуализированы на темном фоне. Отрегулируйте продолжительность съемки до 60 секунд, затем нажмите «Запись».

При появлении запроса введите температуру образца устройства, пометьте образец и сохраните видеоданные по завершении каждого запуска в указанную пользователем папку. Оставьте все параметры анализа в режиме автоматического определения и нажмите кнопку Process Sequence. Записывайте распределение частиц по размерам и концентрацию частиц в виде частиц на миллилитр, как определено программным обеспечением.

Чтобы определить содержание белка OMV, используйте SDS-PAGE и Western Blots для оценки выработки фермента чистоты OMV, а также SpyCatcher или SC для эффективности сшивки SpyTag или ST. Крайне важно подтвердить экспрессию целевых ферментов и якорного белка. Экспрессия рекомбинантных белков часто может быть неудачной по ряду причин, и успешное производство белка должно быть подтверждено до того, как будет определена характеристика OMV.

Для проведения анализа активности фосфотриэстеразы или ПТЭ добавьте пять микролитров от одного до 1000 разведения параоксона в буфере CHES к пяти микролитрам очищенных OMV в 90 микролитрах CHES. Измеряйте абсорбцию на 405 нанометрах и 348 нанометрах каждые 20 секунд в течение примерно двух часов общего времени реакции, чтобы отслеживать прогрессирование-нитрофенола, продукта распада хромогенного параоксона. Наконец, проведите анализ данных в соответствии с текстовым протоколом.

Здесь показаны примеры морфологии очищенных OMV из E.coli через SEM. OMV варьируются в размерах от 50 до 250 нанометров, что определено с помощью приборов для отслеживания частиц. На этом графике показана абсолютная концентрация OMV.

При совместной трансформации N концевого OMP-A-ST с PTE-SC в присутствии арабинозы и IPTG наблюдалось значительное увеличение продукции OMV по сравнению с контрольными образцами. SDS-PAGE и Western Blots, показанные здесь, дополнительно характеризуют содержание белка OMV и экспрессию рекомбинантного белка для OMP-A-ST, нативного OMP-A, PTE-SC и OMP-A-ST-PTE-SC. На этом рисунке общие уровни экспрессии PTE и эффективность упаковки OMV в клеточных гранулах, надосадочной жидкости UC и очищенных гранулах UC OMV были определены путем первоначальных измерений скорости с использованием параоксона в качестве хромогенного субстрата.

В данном случае Triton X-100 был использован для проверки транслокации параоксона через неповрежденные бислои OMV. Разница в активности с детергентом или без него была незначительной, что указывает на то, что параоксон свободно проходит через эндогенные поры на OMV. Наконец, как видно из этого эксперимента, кинетические данные PTE-SC согласуются со стандартным уравнением кинетики фермента Михаэлиса-Ментена для N-концевого OMP-A-ST, преобразованного с PTE-SC в присутствии арабинозы и IPTG и PTE-SC в присутствии активации арабинозы.

После того, как все генетические конструкции созданы и подтверждены, упаковка ферментов и очистка OMV могут быть выполнены в течение двух дней. Третий день необходим для подтверждения и определения характеристик OMV всякий раз, когда разрабатывается новая конструкция. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о проверке показателей безопасности всех материалов и центрифугирующего оборудования.

Кроме того, важно проверить успешность каждого шага, прежде чем переходить к следующему. Описанные здесь этапы определения характеристик могут быть дополнены другими для подтверждения упаковки фермента и морфологии OMV. Концентрация белка, содержание липидов, концентрация ЛПС и многие другие свойства могут варьироваться в зависимости от полезной нагрузки и условий аддукции и могут влиять на последующие приложения.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как очищать и характеризовать заполненные ферментами OMV, а также проводить предварительные анализы для оценки активности ферментного груза. Не забывайте, что работа с бактериями и химическими реагентами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует использовать такие меры предосторожности, как правильная техника асептики и средства индивидуальной защиты.