Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Общая цель данной процедуры — подготовка образцов кристаллов мембранных белков в липидной кубической фазе для серийного кристаллографического сбора данных на синхротронах и источниках рентгеновского свободно-электронного лазера. Этот метод должен помочь ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии мембранных белков, такие как транспорт и передача сигнала через мембрану. Главным преимуществом данной техники является возможность определения структуры мембранных белков в их естественной липидной среде при комнатной температуре с минимальным расходом образца и незначительным радиационным повреждением.

Специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как липидная кубическая фаза представляет собой вязкий гель-подобный материал, с которым сложно работать без специальных инструментов и предварительного опыта. Начните выполнение данной процедуры с реконституции мембранных белков в липидной кубической фазе (LCP), используя шприцы №1 и №2, как описано в текстовом протоколе. После образования прозрачной и гомогенной LCP перенесите весь образец в шприц №2.

Отсоедините шприц номер один, оставив соединитель подключенным к шприцу номер два. Присоедините съемную иглу к другому чистому шприцу объемом 100 мкл, который будет называться шприцем номер три. Наберите в него примерно 70 мкл раствора осадителя.

Отсоедините иглу от шприца № 3, оставив тефлоновую сферу внутри шприца. Соедините шприцы № 2 и № 3 с помощью соединителя, убедившись, что тефлоновые сферы в обоих шприцах расположены правильно. Осторожно и плотно закрутите соединитель.

Расположите соединенные шприцы вертикально так, чтобы шприц № 2 находился снизу, и медленно, равномерно введите образец LCP с белком из шприца № 2 в шприц № 3 до тех пор, пока струйка LCP не коснется поршня шприца № 3. Объем введенного LCP составит примерно 1/10 от начального объема осадителя в шприце № 3. Проверьте объем по шкале обоих шприцев.

Затем отсоедините шприц номер два. Теперь соединитель подключен только к шприцу номер три, в котором образец погружен в раствор осадителя. Используйте Parafilm, чтобы полностью герметизировать шприц номер три, включая интерфейс поршня и шприца, открытый конец соединителя и гайку иглы.

Неполная герметизация на этом этапе может привести к изменению условий осаждения и дегидратации образца. Повторите шаги по введению образца LCP, содержащего белок, чтобы организовать кристаллизацию в шести дополнительных шприцах, используя в общей сложности примерно 50 µl образца LCP. Храните герметичные шприцы в пластиковом пакете с застежкой, в который помещены одна или две безворсовые очистительные салфетки, предварительно смоченные водой, чтобы предотвратить дегидратацию образца.

Запечатайте пакет и храните шприцы в инкубаторе при температуре 20 °C в течение всего периода роста кристаллов. Для обнаружения кристаллов каждые 12–24 часа извлекайте шприцы из инкубатора, чтобы осмотреть образцы LCP непосредственно внутри шприцев под стереомикроскопом со скрещенными поляризаторами. Кристаллы определяются как плотно упакованные блестящие частицы или, в случае меньшего размера кристаллов, как равномерное свечение нити LCP.

Поместите запечатанные шприцы обратно в пакет и храните при 20 °C для последующего использования. Этап титрования липидов необходим для поглощения избытка раствора осадителя и предотвращения замерзания липидов при введении в пучок рентгеновского лазера на свободных электронах. Примерно за один час до начала сбора данных извлеките шприцы с образцами из инкубатора, настроенного на 20 °C.

Выберите от двух до четырех шприцев для объединения образцов, исходя из схожести внешнего вида кристаллов и условий кристаллизации. Осторожно удалите герметизирующую пленку Parafilm с выбранных шприцев. Снимите соединитель шприцев и прикрепите чистую съемную иглу к первому выбранному шприцу.

Осторожно и медленно нажмите на поршень, чтобы выдавить осадитель через иглу в микроцентрифужную пробирку. Будьте предельно внимательны на этом этапе, так как чрезмерное давление на поршень может привести к выбросу части LCP с кристаллами вместе с раствором осадителя, что повлечет за собой частичную или полную потерю образца. Прекратите движение поршня, когда большая часть осадителя будет удалена, а LCP соберется у входа в иглу.

Повторите эту процедуру для остальных выбранных шприцев. Чтобы объединить полученные образцы LCP, соедините два шприца с помощью чистого соединителя. Нажмите на plunger одного шприца, чтобы перенести весь образец из одного шприца в другой.

Отсоедините пустой шприц. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока весь LCP-материал, содержащий кристаллы, не будет собран в одном шприце. Удалите максимально возможное количество осадителя.

Добавьте примерно 5 µL 7,9 MAG или исходного короткоцепочечного MAG-липида матрицы в пустой шприц. Соедините этот шприц со шприцем, содержащим объединенный образец, с помощью соединителя для шприцов и перемешайте, поочередно нажимая на поршни шприцев. Повторяйте процедуру до полного поглощения остаточного раствора и образования однородной прозрачной LCP.

Перенесите весь смешанный образец LCP в один шприц и отсоедините пустой шприц. Прикрепите к шприцу с объединенным образцом загрузочную иглу инжектора LCP. Осторожно нанесите примерно 1 µL образца LCP на предметное стекло и накройте его покровным стеклом.

Осторожно нажмите на покровное стекло, чтобы зафиксировать образец. Сделайте снимки образца LCP под стереомикроскопом при максимально возможном увеличении, используя освещение в светлом поле и скрещенные поляризаторы. По возможности сделайте дополнительные снимки с помощью УФ-флуоресцентного микроскопа и системы визуализации, чтобы подтвердить наличие микрокристаллов белка в образце.

Оцените размер и плотность кристаллов. Идеальная плотность кристаллов для эксперимента по сбору данных будет зависеть от размера кристалла, диаметра рентгеновского луча и диаметра струи LCP; в результате частота попадания кристаллов должна составлять примерно от 10 до 40%. Наконец, заполните LCP-инжектор и проведите серийную фемтосекундную кристаллографию LCP, или сбор данных LCP SFX, как описано в текстовом протоколе. Здесь показаны микрокристаллы серотонинового рецептора в комплексе с эрготамином, визуализированные в режиме микроскопа с ярким полем и в режиме микроскопа с перекрестно-поляризованным светом.

Структура комплекса серотонинового рецептора с эрготамином была получена методом LCP SFX. Здесь представлены микрокристаллы сглаживающего рецептора в комплексе с циклопамином, визуализированные с помощью микроскопа в режиме скрещенных поляризаторов. Структура комплекса рецептора с циклопамином была получена методом LCP SFX.

После освоения эта процедура может быть выполнена менее чем за два часа при условии правильного проведения. Хотя данный метод позволяет получить представление о структуре мембранных белков-мишеней, при небольших модификациях его также можно применять к другим белкам. Значение этой методики распространяется на поиск и разработку лекарственных средств, поскольку структуры высокого разрешения служат отличными шаблонами для изучения стандартных взаимодействий лигнанов с белками и помогают в создании более эффективных препаратов.