Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ

Цель этой технологии состоит в том, чтобы предоставить гистологические инструменты, которые интегрируют сложные модельные системы в высокопроизводительной, независимой от наблюдателя и полностью цифровой манере, которая является экономически эффективной и значимой для биологов опорно-двигательного аппарата. Эстология, хотя и имеет решающее значение для большинства биологических исследователей, часто является трудоемкой и не поддается количественной оценке. Поэтому существует потребность в гистологических методах, обеспечивающих эффективный, высокопроизводительный и автоматизированный анализ.

С помощью нашей криогистологической платформы исследователь может связать несколько молекулярных сигналов с конкретными клетками в данном образце, визуализируя и окрашивая одно и то же предметное стекло несколько раз с высокой пропускной способностью. Демонстрировать процедуру будут доктор Си Цзян и Ли Чэнь, научные сотрудники моей лаборатории, которые были пионерами в разработке и применении этих методов. Чтобы начать эту процедуру, удалите образец из формалина, удалите лишнюю ткань и переведите на 30% сахарозу, изготовленную в 1x PBS.

Инкубируйте экземпляры в сахарозе в течение 12-24 часов при четырех градусах Цельсия. Затем заполните криомолд криоэмбедирующей средой и поместите образцы в форму. Затем выровняйте образцы в форме таким образом, чтобы поверхность резки для интересующей области была параллельна дну формы.

После этого поместите криомолд на кусок сухого льда до тех пор, пока тонкий слой криоэмбедирующей среды не замерзнет, фиксируя специи на месте. Затем заполните оставшийся объем криомолда криоэмбедирующей средой, сохраняя при этом криомолд на грануле сухого льда. После этого поместите криомолд в емкость, содержащую 2-метилбутан, предварительно охлажденный сухим льдом.

Как только образцы будут полностью заморожены, удалите криомолд и стряхните избыток 2-метилбутана. Заверните криомолд в целлофан и храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию, или при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В этой процедуре переложите блок образцов из морозильной камеры в криостат, установленный при температуре от минус 20 до минус 25 градусов по Цельсию.

Затем извлеките блок из криомолда и обрежьте излишки криогембирующей среды лезвием бритвы. Затем добавьте немного криовстраиваемой среды на диск для образцов и выровняйте блок так, чтобы поверхность диска с образцами была параллельна нижней поверхности блока. Подождите, пока криоэмбедирующая среда застынет.

После этого поместите диск образца на головку образца и отрегулируйте головку таким образом, чтобы лезвие резало параллельно поверхности блока образца. Далее отрежьте кусочки криоленты, чтобы покрыть интересующую область и предварительно охладите их в криостате. После этого обрежьте блок до уровня в пределах интересующей области, продолжая вносить корректировки по мере необходимости.

Как только вы достигнете интересующей вас области и сможете сделать разрез, смахните стружку с поверхности блока. Затем снимите неадгезивную подложку с криоленты, взявшись за ленту за нелипкие серебряно-золотые язычки. Затем поместите ленту на блок липкой стороной вниз.

Надавите на криоленту с помощью ролика и сделайте разрез с помощью автоматического двигателя или ручного отрезного круга криостата. После этого поместите срез тканью вверх на предметное стекло пластикового микроскопа внутри криостата. Снимите пластиковое предметное стекло с криостата и дайте криовстраиваемой среде расплавиться, чтобы секция прилипла к поверхности предметного стекла.

Повторите секционирование для серийных секций или других областей интереса. После этого поместите секции в выдвижную коробку и храните их при температуре четыре, минус 20 или минус 80 градусов Цельсия, в зависимости от требуемой длины хранения и последующих мер реагирования. Чтобы выполнить метод УФ-отверждаемого клея, сначала наклейте этикетку на предметное стекло микроскопа.

Нанесите каплю УФ-активированного оптического клея на два предметных стекла и с помощью края предметного стекла распределите тонкий слой клея по поверхности предметного стекла. Затем отрежьте серебристо-золотую язычку и положите проклеенный участок тканью вверх, на клеевой слой первого предметного стекла. Наносите секцию раскатными движениями от одного края к другому, чтобы свести к минимуму образование застрявших пузырей под лентой.

После этого снимите заклеенный скотчем участок с первого предметного стекла, затем поместите его на клеевой слой второго предметного стекла и постарайтесь не допустить попадания пузырей. После того, как на каждом предметном стекле будет размещено соответствующее количество секций для данного эксперимента, сотрите излишки клея с окружающих областей. Затем внимательно осмотрите срезы на наличие пузырей или волокон под лентой.

Затем поместите предметные стекла микроскопа под ультрафиолетовый черный свет на пять-десять минут, чтобы сшить клеевой слой. На этом этапе приготовьте раствор эталонного маркера, растворив в 100 микролитрах воды 50 микролитров зеленого и 50 микролитров красных микросфер. Храните раствор в темноте при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем окуните наконечник пипетки в раствор микросферы и нанесите раствор микросферы на каждый участок, прилегающий к интересующей области. Далее просушите горки при комнатной температуре и защитите их от света, накрыв пленкой на 30 минут, если обработка горки в этот день. Если нет, поместите слайды в слайд-бокс при температуре четыре градуса Цельсия.

После окрашивания секций закрепите защитные стекла на слайдах с помощью соединительного монтажного носителя. Чтобы выполнить визуализацию, загрузите предметные стекла в лотки микроскопа и вставьте лотки в стопку лотков сканирующего микроскопа. Затем нажмите на список профилей в программном обеспечении микроскопа, чтобы загрузить профиль для каждого предметного стекла с соответствующим временем экспозиции для каждого фторофора.

Затем нажмите кнопку «Начать сканирование предварительного просмотра», чтобы сделать предварительный просмотр изображения каждого слайда. Программное обеспечение автоматически применит имя файла, считывая штрих-коды, размещенные на надписях слайдов. Кроме того, имя файла может быть вручную назначено каждому слайду.

Задайте области интереса, войдя в мастер обнаружения тканей, нарисовав каждую область с помощью инструмента рисования, внеся необходимые корректировки и сохранив их для последующих раундов визуализации. После настройки каждого слайда начните процесс сканирования, нажав кнопку «Начать сканирование». После каждого раунда визуализации погружайте предметные стекла в банку с коплином, наполненную одним 1x PBS, до тех пор, пока защитные стекла не отвалятся от предметных стекол, перед следующим этапом окрашивания.

После завершения всех раундов обработки изображений экспортируйте изображения из каждого отдельного канала в файлы TIF или JPG для сборки и анализа изображений. На этом рисунке срез бедренной кости трехмесячной мыши был окрашен кальцеином в синий цвет и обработан на предмет накопленного минерала, видимого белым, и меток минерализации, видимых зеленым и красным цветом в первом раунде визуализации. Затем были изображены слайды для активности ловушек, видимых желтым цветом во втором раунде, и активности AP, видимой красным цветом в третьем раунде визуализации.

Наконец, в четвертом раунде слайды были окрашены толуидиновым синим. Эталонные маркеры были визуализированы во время каждого раунда визуализации, включая хромогенный раунд, и были выровнены с помощью специального программного обеспечения. После освоения эта техника может быть выполнена за меньшее время, чем требуется для декальцинации обычного образца.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получать высококачественные изображения минерализованных тканей с высоким содержанием содержимого, которые, как мы надеемся, могут быть более широко использованы скелетно-мышечным сообществом.