Обнаружение рН-зависимой активности Кишечная палочка Сопровождающий HdeB In Vitro и В Vivo

Общая цель этих анализов шаперона in vivo и in vitro состоит в том, чтобы охарактеризовать pH-зависимую активность шаперона HdeB Escherichia coli в условиях кислого pH. Активированные кислотой шапероны выполняют только одну задачу: они должны защищать белки от разворачивания и деградации белков, вызванных кислотой. Эта функция особенно важна для кишечных бактерий, которые должны выжить в кислой среде желудка, если они хотят успешно колонизировать кишечник.

Методы, которые мы представляем здесь, позволяют идентифицировать и охарактеризовать кислотно-активированные шапероны, а также определить условия pH, которые приводят к их активации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как характеризовать шапероны, такие как HdeB in vitro и in vivo, что помогает вам расшифровать механизм его активации. Эти методы были успешно применены для других кислотных защитных шаперонов, таких как HDA, и могут быть дополнительно модифицированы для работы с другими шаперонами и/или стрессовыми условиями.

Проведен мониторинг влияния очищенной HdeB на агрегацию термически разворачивающейся митохондриальной малатдегидрогеназы свиней при различных значениях рН. Диализовали MDH при четырех градусах Цельсия в течение ночи против четырех литров буфера C. Затем концентрировали белок примерно до 100 микромолей с помощью центробежных фильтровальных установок с молекулярной массой 30 килодальтон. Чтобы удалить агрегаты, центрифугируйте белок в течение 20 минут при температуре 20 000 раз G при четырех градусах Цельсия.

Определение концентрации МДН по абсорбции при 280 наномолярах. Затем приготовьте 50 микролитров аликвот MDH и заморозьте аликвоты для хранения. Поместите кварцевую кювету объемом в один миллилитр во флуоресцентный спектрофотометр, оснащенный держателями образцов и мешалками с регулируемой температурой.

Установите длину волны возбуждения и впуска на 350 нанометров. Добавьте в кювету соответствующие объемы предварительно подогретого буфера D при нужных значениях pH. Общий объем составляет 1 000 микролитров.

Установите температуру в держателе кюветы на 43 градуса по Цельсию. Добавьте в буфер 12,5 микромолярных HdeB с последующим добавлением 0,5 микромолярных MDH. Начните следить за рассеянием света.

Инкубируйте реакцию в течение 360 секунд, чтобы обеспечить достаточное раскрытие MDH. Увеличьте pH до семи, добавив от 0,16 до 0,34 объема двух моляров небуферизованного дикалийфосфата, и продолжайте записывать рассеяние света еще 440 секунд. Анализируйте данные так, как описано в текстовом протоколе.

Трансформируйте плазмиду, экспрессирующую HdeB, или контрольный вектор MD, PBAD 18, в штамм BB7224 Delta RPOH с использованием химически компетентных клеток. Этот сорт чувствителен к температуре и должен культивироваться при температуре 30 градусов Цельсия. После 45 секунд теплового шока при температуре 42 градуса Цельсия и перед нанесением покрытия инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия и 200 оборотах в минуту.

Проведите выделение одиночных колоний из положительных клонов и инкубируйте в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия. Приготовьте ночную культуру в 50 миллилитрах LB с ампициллином и культивируйте клетки при 200 об/мин и 30 градусах Цельсия. Разведите на ночь культуры в 40 раз до 25 миллилитров ЛБ с Ампициллином.

Выращивайте бактерии в присутствии 0,5% арабинозы при 30 градусах Цельсия и 200 об/мин до оптической плотности при 600 нанометрах или наружном диаметре 600, равном 1,0, чтобы вызвать экспрессию белка HDEB. Для экспериментов со сдвигом pH используйте LB с ампициллином и арабинозой, чтобы разбавить клетки до OD 600, равного 0,5. Отрегулируйте соответствующие значения pH, добавив соответствующие объемы пятимолярной соляной кислоты.

По истечении указанных временных точек нейтрализовать культуры путем добавления соответствующих объемов пяти моляров гидроксида натрия. Контролируйте рост нейтрализованных культур и жидких культур в течение 12 часов при температуре 30 градусов Цельсия с помощью измерений наружного диаметра. Для исследования оптимального рН шапероновой активности HdeB in vitro нативный MDH разводили в предварительно подогретом буфере указанного pH в присутствии или отсутствии HdeB.

После 360 секунд инкубации агрегация MDH при 43 градусах Цельсия была вызвана путем нейтрализации. В присутствии HdeB сигнал светорассеяния значительно снижается при нейтрализации от pH 4, что указывает на то, что HdeB предотвращает агрегацию MDH. Измерения агрегации очень чувствительны к изменениям температуры или содержания буфера.

Для исключения ложноположительных результатов было исследовано влияние буфера хранения шаперонов на агрегацию клиентов. Буфер хранения HdeB не влиял на агрегацию MDH. Для изучения эффектов HdeB in vivo были проведены pH-зависимые анализы выживаемости с использованием чувствительного к температуре штамма делеции RPOH.

У этого штамма отсутствует большинство шаперонов, и поэтому он более восприимчив к повышенной температуре, низкому pH или окислительному стрессу. Чрезмерная экспрессия HdeB в условиях нейтрального pH не оказала влияния на скорость роста штамма, который рос сравнительно хорошо с контрольным штаммом, содержащим пустой вектор, PBAD 18. Напротив, были обнаружены явные различия в их способности возобновлять рост при обработке pH 3 или pH 4, при этом штамм HdeB с более высокой экспрессией показал воспроизводимо улучшенное восстановление после обработки с низким pH по сравнению с контрольным штаммом.

После освоения очистка может быть выполнена за три дня, анализ на рассеяние in vitro — за один день, а анализ на выживание in vivo — за два дня, если он выполнен правильно. Когда вы проводите эти эксперименты, убедитесь, что вы тщательно продумали свой экспериментальный план, как в отношении типа клиентских белков, так и их концентраций и буферных условий, которые вы используете. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она помогает получить более детальное представление о механизме активации шаперона и его эффектах в контексте in vivo.

И не забывайте, что изучение оптимального pH кислотного защитного шаперона может быть довольно сложной задачей. Это связано с тем, что агрегационное поведение клиентского белка, который вы используете, вероятно, также будет изменяться в зависимости от pH. Поэтому убедитесь, что вы выбираете буферные системы, которые подходят как для шаперона, так и для клиентского белка.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ спин-понижателя по странице SCS, в автоматически количественно опосредованном шапероном подавлении агрегации клиентов.