Высокая пропускная способность, Multiplexed и Targeted Протеомный CSF Анализ на Количественно нейродегенеративных биомаркеров и аполипопротеина Е изоформы Статус

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы быстро и недорого количественно оценить множественные биомаркеры в спинномозговой жидкости (СМЖ) для оценки их использования для диагностики и мониторинга лечения. Это новый анализ, который позволяет измерить биомаркеры, которые раньше было невозможно измерить. И мы думаем, что это может быть использовано в диагностических целях, а также для дифференциации различных нейродегенеративных заболеваний и, возможно, также для получения прогностической информации.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он разработан таким образом, чтобы быть быстрым, простым в подготовке образцов, высокоспецифичным и экономически эффективным для внедрения в клиническую лабораторию. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику, поскольку этот высокопроизводительный тест может быть использован в будущих клинических испытаниях для новых методов лечения нейродегенерации. Эта методология также может быть применена к другим заболеваниям и тканям, таким как моча при заболеваниях почек, плазма при кардиомиопатии и клетки для плюрипотентности.

Чтобы начать эту процедуру, ресуспендируйте желаемые синтетические пептиды до исходной концентрации один миллиграмм на миллилитр, в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте один из 10 разведений пептида из исходной концентрации и объедините 1000 пикомолев каждого пептида в микроцентрифужную пробирку с низким связыванием. Высушите объединенный образец пептида в концентраторе SpeedVac.

По окончании храните образец при температуре минус 20 градусов Цельсия. Далее 100 микролитров спинномозговой жидкости разлить в микроцентрифужные пробирки с низким связыванием. Сублимационная сушка образцов спинномозговой жидкости.

Ресуспендировать аликвоту объединенного образца пептида в буфере для разложения до получения концентраций 10 и одного пикомола на микролитр. Теперь добавьте объединенный образец пептида в лиофилизированные 100-микролитровые аликвоты ликвора в нулевую, одну, две, пять, 10 и 15 пикомолярных концентраций. Затем добавьте 20 нанограммов неповрежденного неродственного белка, который будет действовать как внутренний стандарт и контролировать эффективность переваривания трипсина.

Добавьте в аликвоты ликвера буфер для дигеста до конечного объема 20 микролитров и перебейте образцы в вихрь. После этого переваривайте образцы в соответствии со стандартным протоколом, добавляя 1,5 микролитра дитиотреита, и встряхивайте при комнатной температуре в течение одного часа. После этого добавьте в образцы три микролитра йодоацетамида и взбалтывайте при комнатной температуре в течение 45 минут в темноте.

Затем добавьте 165 микролитров дважды дистиллированной воды. Добавьте в образцы 10 микролитров модифицированного раствора трипсина с конвенированием 0,1 микрограмма на микролитр, ресуспендированного в 50-миллимолярном буфере бикарбоната аммония. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия на ночь.

Затем остановите разложение, заморозив образцы. После размораживания ликвор переваривается на льду, центрифугировать при 16 000 г в течение 10 минут. Когда закончите, перелейте по 60 микролитров каждого вареза в стеклянную вставку-300 микролитров

Используя систему LC-MS, оснащенную колонкой C18 UPLC, введите самую высокую концентрацию от стандартной точки кривой, используя 10-минутный линейный градиент от одного до 40% ацетонитрила. Как только прогон будет завершен, откройте результирующую хроматограмму в программном обеспечении и отметьте время удержания и два самых интенсивных перехода для каждого пептида. На основе этой информации обновите ранее созданный мониторинг множественных реакций, или метод MRM с временными каналами для измерения пептидов.

Для поддержания чувствительности в каждом канале необходимо иметь количество точек на пик больше восьми и время задержки более 0,01 секунды в течение как минимум одного перехода для каждого пептида. Включите задержки растворителя в метод MRM, выбрав задержки растворителя в событиях метода в файле метода MS. Очень важно правильно подобрать правильный пик при коротком методе ВЭЖХ.

Это можно сделать с помощью спайковых пептидов в матрице, которые используются для стандартной кривой, и наблюдения за множественными переходами во время разработки метода. Наконец, вручную проверьте аннотацию данных, чтобы убедиться в точности. Проанализируйте каждый пептид и его соотношение в соответствии с соответствующим внутренним стандартом, меченным стабильными изотопами.

Здесь показана хроматограмма значимых пептидных маркеров из высокопроизводительного анализа спинномозговой жидкости. Данные дают стандартизированные отношения к соответствующему внутреннему стандарту, меченному стабильными изотопами, которые могут быть использованы для определения абсолютных концентраций СМЖ и статистического анализа изменений в клинических образцах. Количественное определение 74 пептидов, включенных в этот анализ СМЖ, показало, что 25 из них были значительно изменены в СМЖ у пациентов с деменцией, а результаты маркеров деменции про-орексина и хитиназы-3-подобного белка YKL представлены здесь.

ApoE4 является известным фактором риска развития болезни Альцгеймера, и обнаружение изоформ ApoE основано на обнаружении соответствующих пептидов для аминокислотных изменений для изоформ E2 и E4. Здесь показана ожидаемая пиковая картина для каждой комбинации изоформ. После того, как метод настроен, анализ можно провести за один день, если он выполнен правильно. После разработки этого метода стало возможным измерить новый набор биомаркеров с высокой аналитической чувствительностью и специфичностью, и это даст возможность исследователям по-новому оценивать нейродегенеративные заболевания.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать и оптимизировать анализ MRM для чувствительности и специфичности. Не забывайте, что работа с DTE, термитами, муравьиной кислотой и человеческими тканями может быть чрезвычайно опасной, и во время этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.