Антитело Этикетировочное с флуоресцентными красителями с использованием магнитных Protein A и G белка бусин

Общая цель данного метода заключается в мечении антител флуоресцентными красителями из очищенных образцов или непосредственно из среды культивирования клеток с использованием магнитных шариков с белками A или G. Этот метод может быть использован для оптимизации химического мечения даже небольшого количества антител в среде культивирования клеток, что позволяет улучшить последующее применение антител.

Основными преимуществами данного метода являются отсутствие необходимости в очистке антител, возможность использования аминной или тиольной химии, а также возможность автоматизации или ручного выполнения процедуры. Начните с равномерного ресуспендирования гранул путем осторожного встряхивания. Затем перенесите 50 µL гранул в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.

Затем поместите пробирку в магнитный штатив. Через 10 секунд осторожно замените буфер для хранения 250 µL буфера для связывания антител и тщательно перемешайте гранулы. Еще через 10 секунд осторожно замените связывающий буфер 1 mL интересующего антитела.

Перемешивайте образец в течение 60 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации поместите пробирки на магнит и удалите супернатант, когда гранулы сместятся к стенкам пробирки. Затем промойте смесь гранул и антител дважды по 10 секунд, используя по 250 µL промывочного буфера для связывания антител за одну промывку.

Для маркировки антител с помощью аминной химии после второго промывания замените промывочный буфер на 100 µL буфера для аминной конъюгации и добавьте 2,5 µL свежеприготовленного аминореактивного красителя на 100 µg антител. Перемешивайте образец на вортексе в течение 60 минут при комнатной температуре, чтобы поддерживать бусины во взвешенном состоянии во время маркировки. Затем снова поместите пробирку на магнит на 10 секунд и удалите супернатант.

Промойте гранулы дважды буфером для промывки при связывании антител, как было показано ранее. Затем замените промывочный буфер 50 µL элюирующего буфера и перемешивайте гранулы в течение пяти минут. Снова поместите пробирку на магнит на 10 секунд и перенесите элюированные антитела в новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 5 µL нейтрализующего буфера.

Элюируйте антитело еще раз, как было показано ранее, собирая элюированные образцы. Затем измерьте оптическую плотность конъюгата антитело-краситель при 280 нанометрах и при значении lambda max для данного красителя. Для маркировки антител с помощью тиольной химии после второго промывания замените промывочный буфер на 250 microliters буфера для тиольного конъюгирования и перемешайте гранулы, аккуратно дозируя жидкость пипеткой.

Через 10 секунд дважды промойте гранулы промывочным буфером для связывания антител. Затем замените промывочный буфер на 100 µL буфера для конъюгации тиолов и добавьте DTT до конечной концентрации 2.5 mM. Перемешивайте гранулы еще в течение 60 минут.

Затем снова поместите гранулы на магнит на 10 секунд и удалите буфер. Далее, при осторожном перемешивании, добавьте к гранулам 250 µL буфера для тиол-конъюгации. Через 10 секунд дважды промойте гранулы промывочным буфером для связывания антител, заменив после второго промывания 100 µL свежего буфера для тиол-конъюгации.

Теперь добавьте 2,5 µL свежеприготовленного тиол-реактивного красителя на 100 µg антител и перемешивайте гранулы в течение 60 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации снова поместите пробирку на магнит на 10 секунд. Затем осторожно перемешав, замените супернатант 250 µL свежего буфера для тиол-конъюгации.

Через 10 секунд промойте гранулы дважды. Затем замените буфер для промывки на 50 µL элюирующего буфера и проведите элюцию конъюгата антител дважды, как было продемонстрировано ранее. После этого измерьте абсорбцию конъюгата антитело-краситель при 280 nm и на длине волны lambda max для соответствующего красителя.

Высокое сродство антител к белку G, сильное взаимодействие магнита с бусинами и оптимизация метода перед очисткой на бусинах в совокупности обеспечивают минимальные потери антител в ходе реакции мечения, что подтверждается эффективным выходом трех различных изотипов мышиных антител после флуоресцентного двойного мечения по сравнению с простой очисткой. Этот выход также виден на гелях, окрашенных кумасси, где низкие свойства неспецифического связывания магнитных бусин с белком G обеспечивают присутствие высокоочищенных двойных флуоресцентно-меченных тяжелых и легких цепей. Мечение на магнитных бусинах с белком A также совместимо с различными флуоресцентными красителями, что обеспечивает высокий выход и хорошие соотношения краситель/антитело.

При должном навыке и правильном выполнении эта процедура занимает от двух до трех часов. Это позволяет обрабатывать несколько образцов вручную или использовать автоматизированную платформу для повышения пропускной способности. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости постоянно поддерживать магнитные частицы во взвешенном состоянии.

Выберите подходящий объем магнитных бусин для образца. Оптимизируйте количество флуоресцентного красителя для интересующего антитела. После выполнения этой процедуры следует проверить функциональность меченых антител с помощью соответствующих биологических методов анализа, таких как ELISA, FACS или клеточные тесты.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как маркировать очищенные и неочищенные антитела флуоресцентными метками или другими малыми молекулами, такими как биотин или цитотоксические препараты, с использованием магнитных частиц с белком A или G.