Колометрической Обнаружение бактерий с помощью лакмусовой тест

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать простой модифицированный тест с использованием лакмуса для обнаружения бактерий. В данном методе описывается, как активируемый E.coli расщепляющий РНК ДНК-энзим может быть соединен с платформой передачи сигнала на основе уреазы для обеспечения изменения цвета в ответ на присутствие E.coli. Двумя основными преимуществами этой методики являются простота проведения теста и возможность ее применения к другим расщепляющим РНК ДНК-энзимам, реагирующим на соответствующие аналиты.

Процедуру продемонстрируют Сеперх Манчери и Дингран Чанг, аспиранты из лаборатории доктора Инфу Ли в Университете Макмастера. После приготовления реагентов и буферов согласно текстовому протоколу приготовьте стоковый раствор сукцинимидил-4-циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), растворив 1 mg SMCC в 676 µL DMSO. Перемешайте на вортексе и храните на льду до использования.

Растворите один миллиграмм уреазы в одном миллилитре 1x PBS и поместите раствор на лед до начала использования. Для синтеза ДНК уреазы (UrDNA) добавьте 10 мкл 100 мкМ LD1 в микроцентрифужную пробирку объемом 2,5 мл. Затем добавьте 140 мкл дважды дистиллированной воды и 40 мкл 10x PBS, после чего перемешайте на вортексе.

Затем добавьте 80.5 µL стокового раствора SMCC и 159.5 µL DMSO. После этого снова перемешайте смесь на вортексе и кратковременно центрифугируйте в настольной центрифуге. Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в инкубаторе или термоблоке в течение 60 минут.

После инкубации добавьте в пробирку 200 мкл 1x PBS, 60 мкл 3 M ацетата натрия и 1,5 мл холодного 100% этанола. Перемешайте смесь на вортексе и выдержите реакционную смесь при температуре -20 °C в течение 30 минут. Центрифугируйте раствор при 20 000 ×g и 4 °C в течение 20 минут.

Затем удалите супернатант и высушите осадок в вакууме. К высушенному осадку добавьте 400 µL стокового раствора уреазы и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 часов. Перенесите 200 µL неочищенного конъюгата в предварительно промытую центрифужную фильтрующую колонку с пределом отсечения 100 000 Дальтон.

Центрифугируйте колонку при 14 000 ×g в течение пяти минут. Перенесите оставшиеся 200 µL сырого конъюгата в колонку и центрифугируйте при 14 000 ×g в течение пяти минут. Затем извлеките колонку и поместите ее в перевернутом виде в новую двухмиллилитровую пробирку для микроцентрифугирования.

Центрифугируйте перевернутую колонку и пробирку при 1 000 ×g в течение двух минут. После извлечения пробирки для сбора добавьте в центрифужную колонку 30 µL 1x PBS, чтобы промыть мембрану для дополнительного извлечения конъюгатов. Снова переверните колонку и поместите ее обратно в пробирку для сбора.

Центрифугируйте колонку при 1 000 ×g в течение двух минут. Извлеките и утилизируйте колонку. Храните UrDNA при температуре четыре градуса Цельсия до использования.

Для иммобилизации на магнитных бусинах РНК-расщепляющего ДНКзима, активируемого E.coli (EC1), и UrDNA, тщательно перемешайте сток магнитных бусин и перенесите 100 мкл суспензии бусин в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Затем поместите пробирку на магнитный штатив для изоляции бусин. Удалите супернатант с помощью пипетки и добавьте в пробирку 150 мкл связывающего буфера (BB).

Извлеките пробирку из штатива и осторожно постучите по ней, чтобы повторно суспендировать гранулы до получения гомогенного раствора. После повторения промывки буфером BB еще два раза (при условии, что гранулы находятся в суспензии с BB), добавьте 10 µL 10 µM EC1. Осторожно перемешайте, постукивая по пробирке.

Инкубируйте раствор в течение 30 минут при осторожном встряхивании. Чтобы избежать агрегации бусин, постукивайте по пробирке каждые две-три минуты. Затем снова поместите микроцентрифужную пробирку на магнитный сепаратор, чтобы изолировать бусины, и удалите супернатант с помощью пипетки.

Затем трижды промойте гранулы, используя по 150 µL BB. После завершения промывки суспендируйте гранулы в общем объеме 150 µL BB. К этому раствору добавьте 15 µL UrDNA и нагрейте образец при 45 °C в течение двух минут, затем охладите раствор до комнатной температуры и инкубируйте в течение двух часов. Поместите микроцентрифужную пробирку обратно на магнитный штатив, чтобы изолировать гранулы, и удалите супернатант с помощью пипетки.

Добавьте 100 µL реакционного буфера (RB), затем извлеките пробирку из магнитного штатива и осторожно ресуспендируйте гранулы. После подготовки клеток E.coli согласно текстовому протоколу, проведите предварительную промывку микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 mL, добавив 100 µL RB и перемешав на вортексе. Затем удалите буфер. Добавьте 15 µL собранного комплекса EC1 в промытую пробирку, поместите пробирку на магнитный штатив и аспирируйте супернатант.

Извлеките пробирку из штатива, добавьте 100 мкл RB и осторожно ресуспендируйте магнитные частицы. После двухкратной промывки частиц буфером RB и его удаления добавьте в пробирку 10 мкл образца E.coli и осторожно перемешайте содержимое, постукивая по пробирке. Затем инкубируйте реакционную смесь при комнатной температуре в течение одного часа.

После инкубации добавьте 90 µL дважды дистиллированной воды и поместите пробирку на магнитный штатив. После примерно трех минут магнитного разделения осторожно перенесите 85 µL супернатанта в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл. Очень важно аккуратно отпипетировать раствор, чтобы не захватить магнитные частицы.

Эти бусины нагружены уреазой и будут давать ложноположительный сигнал. Добавьте 15 µL 0,04% фенолового красного и 100 µL раствора субстрата. Затем сделайте фотографии через определенные интервалы времени, чтобы зафиксировать изменение цвета.

Исходный цвет при лакмусовом тесте должен быть желтым, что соответствует pH раствора ниже 5,5. При необходимости исходный pH лакмусового теста можно отрегулировать с помощью слабого буфера, например, 1 мМ буфера ацетата натрия при pH 5. На данном рисунке показаны результаты бактериального лакмусового теста, в котором в качестве ДНКзима использовался активируемый E.coli РНК-расщепляющий ДНКзим EC1, а в качестве pH-индикатора — феноловый красный.

Как свидетельствует отсутствие изменения цвета при отсутствии E.coli, EC1 обладает высокой специфичностью и проявляет минимальную активность по отношению к другим бактериям. Интенсивность изменения цвета зависит как от количества клеток E.coli, использованных на этапе активации ДНКзима, так и от времени, отведенного на этап гидролиза мочевины. Большее количество клеток E.coli приводит к более выраженному изменению цвета, а более длительное время гидролиза мочевины позволяет обнаружить меньшее количество клеток.

На этом графике показано изменение pH, контролируемое с помощью портативного pH-метра. Присутствие 10⁷ клеток E.coli привело к постепенному повышению pH на три единицы в течение 10 минут. Напротив, при отсутствии E.coli в тех же условиях detectable изменений pH не наблюдалось.

После освоения эта методика может быть выполнена за два часа при условии правильного соблюдения всех этапов. При выполнении данной процедуры важно помнить, что уреаза обладает высокой активностью, поэтому недостаточная промывка или загрязнение приведут к ложноположительному результату. После применения данной процедуры этот метод может быть использован для тестирования на наличие E.coli в более актуальных условиях, например, при анализе качества воды в окружающей среде.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать простой лакмусовый тест для выявления E.coli. Не забывайте, что этот тест может быть использован для обнаружения патогенных штаммов E.coli, которые крайне опасны. Перед проведением любых тестов на патогенные бактерии вам необходимо пройти курс обучения по биобезопасности.