Общая цель данного эксперимента — изучить последствия взаимодействия активированных T-клеток с эндотелиальными клетками для их целостности и проницаемости. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейроиммунологии, например, о том, как прямое взаимодействие T-клеток и эндотелиальных клеток влияет на целостность и проницаемость гематоэнцефалического барьера. Основным преимуществом данной методики является возможность автоматизированной оценки функции барьера в режиме реального времени при направленной модуляции взаимодействия T-клеток и эндотелиальных клеток.

Значение данного метода распространяется на терапию аутоиммунных заболеваний ЦНС, поскольку он позволяет изучить опосредованное Т-клетками нарушение целостности гематоэнцефалического барьера, что является критическим этапом патогенеза таких заболеваний. Данный метод сосредоточен на свойствах гематоэнцефалического барьера у мышей при ЭАЭ, однако он также может быть применен к моделям гематоэнцефалического барьера крыс или человека, а также к исследованиям других аутоиммунных заболеваний ЦНС.

Как правило, люди, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за сложности обеспечения оптимального времени при совмещении первичного культивирования эндотелиальных клеток и активации Т-клеток. Мы разработали этот метод в ходе исследования влияния различных уровней активации Т-клеток на свойства гематоэнцефалического барьера при ЭАЭ — животной модели рассеянного склероза. Визуальная демонстрация метода имеет критическое значение, так как освоить постановку совместного культивирования Т-клеток и эндотелиальных клеток сложно, поскольку исходные различия в количестве Т-клеток между лунками могут привести к последующему искажению результатов.

Для начала данной процедуры на пятый день после изоляции MBMEC предварительно обработайте проницаемые вставки, нанеся 80 µL раствора для покрытия MBMEC на каждую вставку. Инкубируйте их при 37 °C и 5% CO2 в течение трех часов. После удаления раствора для покрытия MBMEC из вставок промойте MBMEC, добавив по 2 mL PBS комнатной температуры в каждую лунку, аспирируя его через одну минуту, затем повторите эту процедуру еще раз.

Затем добавьте 0,05% Trypsin EDTA в объеме 300 µL на лунку и инкубируйте в течение пяти-десяти минут. После этого добавьте в каждую лунку два миллилитра среды MBMEC, чтобы остановить трипсинизацию. Затем перенесите собранные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте образец при 700 ×g в течение восьми минут при температуре 4 °C.

Через восемь минут удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре среды MBMEC без пуромицина. Для подсчета клеток смешайте 90 мкл 0,04% раствор трипанового синего. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с полученным раствором, затем перенесите 10 мкл смеси в пространство между покровным стеклом и камерой гемоцитометра.

Затем засейте по 10⁴ клеток на каждый вкладыш. Добавьте 810 µL среды MBMEC в нижний отдел каждой лунки и поместите планшет с вкладышами в инкубатор до начала измерения TEER. Для стимуляции CD4-положительных T-клеток предварительно обработайте 96-луночный планшет с круглым дном очищенными антителами anti-mouse CD3 в требуемой конечной концентрации в течение трех часов при 37 °C.

После изоляции T-клеток дважды промойте предварительно покрытый планшет раствором PBS. Затем добавьте очищенные антитела к CD28 к изолированным T-клеткам до нужной конечной концентрации и тщательно перемешайте. После этого посейте T-клетки и инкубируйте их при 37 °C в течение двух-трех дней.

Для подготовки к измерению TEER поместите 24-луночный модуль прибора TEER в ламинарный шкаф. Снимите крышки и с помощью пинцета установите в прибор инсерты с MBMEC. Затем осторожно, между стенкой лунки модуля и инсертом, пипеткой внесите 810 µL свежей среды в нижний отдел лунок модуля.

После этого закройте крышки и поместите прибор в инкубатор. Подключите прибор к компьютеру. Затем включите контроллер прибора и запустите программное обеспечение.

В сплывающем окне выберите «New Measurement», отметьте флажки «Check show TER» и «show Ccl». Затем нажмите start. После завершения первого измерения на вкладке Results выберите «check all wells», чтобы просмотреть все значения TEER и Ccl.

Затем сохраните файл. Далее выберите временную точку для совместного культивирования MBMECs с Т-клетками, когда значение Ccl стабильно и ниже 1 мкФ/см², а значение TEER достигло своего максимума. Внимательно проверьте абсолютные значения TEER и Ccl и исключите лунки, в которых MBMECs не образовали достаточно плотный монослой, сняв флажки с соответствующих лунок.

Сгруппируйте остальные лунки, щелкнув правой кнопкой мыши по лункам и выбрав «add well to new average well». В появившемся окне присвойте группе имя и повторите эти действия для всех отдельных лунок, которые необходимо сгруппировать. Затем проверьте все усредненные лунки, чтобы подтвердить, что во всех них начальные условия перед совместным культивированием одинаковы. На вкладке «experiment» нажмите «pause».

Отключите прибор и выньте его из инкубатора. Затем снимите крышки в ламинарном шкафу. После этого удалите часть среды из вставки в верхнем отделении лунки.

Добавьте Т-клетки к MBMEC, осторожно перенеся пипеткой 150 µL среды. Затем снова подключите прибор и нажмите «возобновить измерение» (resume measurement). Через 24 часа нажмите «стоп» (stop) во вкладке эксперимента и сохраните файл.

Здесь представлена веретенообразная морфология при иммунофлуоресцентном окрашивании на PECAM-1 и Cldn-5 через пять дней после выделения MBMEC. Приведены значения TEER и Ccl до и после группировки отдельных лунок перед добавлением T-клеток. Синяя кривая не используется в эксперименте, так как в данной лунке MBMEC не достигли такого же высокого значения TEER, как в других лунках.

В данном эксперименте от 35 до 55 специфических CD4-положительных Т-клеток стимулировали антигенспецифическим образом в течение пяти дней. Наивные Т-клетки и провоспалительные цитокины, интерферон гамма и TNF-alpha, служили в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно. Т-клетки стимулировали одинаковым количеством антител к CD3 и CD28; при этом клетки, культивируемые в течение трех дней, проявили большую склонность к нарушению барьерной функции по сравнению с Т-клетками, культивируемыми только два дня.

Полученные здесь результаты показывают, что стимулированные T-клетки, но не их супернатанты, вызывали значительное повреждение MBMECs, что указывает на критическую роль прямого контакта между T-клетками и MBMECs в нарушении барьерной функции. С другой стороны, добавление ингибитора гранзима B два в культуру T-клеток в большей степени восстанавливало целостность MBMEC, что указывает на цитолитическую молекулу как на важный фактор повреждения MBMEC и последующего снижения TEER. После освоения методики этот эксперимент можно выполнить за 12 дней при правильном соблюдении всех этапов. При выполнении данной процедуры важно помнить о выборе правильного момента времени для создания совместной культуры T-клеток и эндотелиальных клеток.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы анализа, такие как иммунофлуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия и вероятностный анализ. Это позволяет ответить на дополнительные вопросы, например: как данное взаимодействие влияет на экспрессию молекул плотных контактов, проницаемость и степень трансмиграции T-клеток? После разработки этот метод открыл исследователям в области нейроиммунологии путь к изучению аутоиммунных заболеваний ЦНС у мышей.

После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как оценивать прямые взаимодействия между активированными T-клетками и эндотелиальными клетками с точки зрения целостности и проницаемости гематоэнцефалического барьера.