Производство плюрипотентных стволовых клеток из амниотической жидкости для мыши клеток с использованием транспозона системы

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и перепрограммировании клеток амниотической жидкости мышей с помощью транспозонной системы. Главное преимущество данной методики в том, что она легко выполняется. В терапевтических условиях клетки плода человека могут быть дифференцированы в клетки, представляющие интерес для тестирования лекарств или тканевой инженерии, чтобы подготовить другой способ специфической терапии пациента до родов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы программирования. Транспозонная система эффективна в различных типах клеток. Он больше подходит для клинического подхода в отношении вирусных векторов и позволяет производить IPS-клетки, свободные от оксино.

Чтобы начать изоляцию, очистите брюшную стенку плотины, используя 70-процентный этанол. С помощью ножниц выполняют лапаротомию по срединной линии, надрезая по длине брюшной стенки, чтобы получить доступ к брюшной полости. С помощью щипцов обнажите матку, а затем иссеките ее с помощью ножниц.

Переложите матку в 100-миллиметровую посуду, наполненную стерильным 1xPBS и держите на льду. Поместите чашку под стереомикроскоп при 10-кратном увеличении и удерживайте матку щипцами, удаляя стенку матки ножницами, стараясь не повредить плодные оболочки. Соберите плод в 100-миллиметровую посуду, наполненную стерильным 1XPBS и положите на лед.

Захватите плаценту одного плода тонконаправленными щипцами и переместите ее в чистую 100-миллиметровую посуду. Здесь аккуратно извлеките желточный мешок. Нарушите действие амниона с помощью щипцов и с помощью инсулинового шприца, соберите 30 микролитров околоплодных вод.

Перелейте жидкость в конический флакон объемом 15 миллилитров. Повторите этот процесс для каждого плода, каждый раз собирая жидкость в один и тот же флакон. Затем промойте каждый плод стерильным 1XPBS с добавлением однопроцентной фетальной бычьей сыворотки и соберите ее в коническую пробирку объемом 15 миллилитров вместе с амниотической жидкостью.

Центрифугируйте пробирку при 145 умноженных на G в течение пяти минут, а затем под ламинарным проточным колпаком удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в двух миллилитрах питательной среды для амниотической жидкости. Возьмите шестилуночный шестилуночный планшет, покрытый желатином, содержащий обработанные миомицином-С эмбриональные фибробласты мышей или MEF, а затем засейте два миллилитра клеток на планшет.

Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа, меняя среду через день. Продолжайте культивирование в течение семи дней, пока клетки не будут готовы к трансфекции. Чтобы начать трансфекцию, в микроцентрифужной пробирке с одной целой пять миллиметров смешайте один микрограмм плазмиды транспозона с нулем целых пяти десятых микрограммов плазмиды экспрессии транспозазы и нулем целых пяти десятых микрограммов плазмиды обратного тетрациклинового трансактиватора.

Разбавьте до 100 микролитров с помощью d-man. Добавьте восемь микролитров реагента для трансфекции в микроцентрифужную пробирку, содержащую ДНК. Выдерживайте эту смесь в течение 15 минут при комнатной температуре.

Взяв шестилуночный планшет с клетками ФП мыши, по каплям добавьте 100 микролитров смеси ДНК трансфективного агента в лунку, распределяя путем осторожного перемешивания с конечным объемом два миллилитра на лунку. Оставьте клетки на 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия в пятипроцентном углекислом газе. На следующий день удалите питательную среду, а затем накормите каждую лунку клеток двумя миллилитрами свежей среды iPS AF с добавлением одной целой пяти микрограммов на миллилитр доксициклина, чтобы индуцировать экспрессию факторов Яманаки.

Ежедневно подкармливайте клетки свежей докссодержащей средой без прохода с этого места. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом в течение 24 часов после первого лечения доксицилцином, чтобы найти любую экспрессию mCherry и ежедневно с этого момента для образования колоний. Как только будет замечено образование колоний, соберите отдельные колонии в 50 микролитров среды для клеточных культур.

Затем перенесите их последовательно в отдельные лунки 96-луночного планшета для культивирования тканей с обработанным митомицином с МЭФ. На следующий день добавьте по 50 микролитров трипсина в каждую лунку и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы диссоциировать колонии на отдельные клетки. После инкубации пипеткой впрыскивайте жидкость вверх и вниз для дальнейшей дезагрегации колоний.

Перенесите 50 микролитров трипсиновой клеточной смеси в новую лунку, содержащую инактивированный MEF, а затем верните клетки в инкубатор. Когда клетки достигнут 60-70-процентного слияния, разделите их в новую лунку 24-луночного планшета, а затем продолжайте инкубацию при комнатной температуре. Как только эти клетки достигнут 60-70-процентного слияния, переверните клетки по одной-две в две лунки, одна из которых содержит доксициклин, а другая без него, чтобы убедиться, что колонии также будут расти в отсутствие доксициклина.

Продолжайте поддерживать колонии IPS AF и независимую от доксициклина среду на инактивированном MEF при температуре 37 градусов Цельсия в пятипроцентном углекислом газе. Ежедневно меняйте среду до тех пор, пока клетки не будут готовы к окрашиванию, визуализации и экстракции РНК. При этом стабильные независимые от доксициклина индуцированные плеврипотентные амниотические GFP-положительные клетки мышей экспрессируют маркеры плевропотентности, необходимые для подтверждения успешного перепрограммирования.

Анализ ОТПЦР с использованием клеток R1 ES в качестве контроля показал экспрессию индуцированных маркеров плевропотентности в присутствии или отсутствии доксициклина. Экспрессия гена, бета-2 микроглобулина, также наблюдалась во всех трех типах клеток. Тератомам, выделенным от мышей, которым вводили индуцированные плевропотентные клетки, подвергали иммуноокрашиванию.

Обнаружение альфафетального белка, альфа-гладкомышечного актина и бета-3 тубулина в новообразованиях подтверждает дифференцировку клеток во все три зародышевых слоя: эктодерму, мезодерму и энтодерму. Кроме того, анализ методом ОТПЦР эмбриоидных телец in vitro и клеток тератомы in vivo подтверждает экспрессию генов-маркеров зародышевого слоя для мезодермы, энтодермы и эктодермы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и перепрограммировать клетки амниотической жидкости мышей.

Это простая и безопасная процедура, которая может быть применена также к клеткам амниотической жидкости человека из образца, полученного в результате рутинной диагностики или кесарева сечения.