Долгосрочный высокого разрешения Прижизненные микроскопии в легких с помощью вакуумного стабилизированный визуализации окна

Общая цель данного метода заключается в проведении долгосрочной одноклеточной визуализации интактного легкого с высоким разрешением с использованием стабилизированного вакуумом смотрового окна. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, например, о том, какие взаимодействия устанавливаются между стромой и опухолевыми клетками на самых ранних этапах метастазирования. Основным преимуществом данной техники является теоретическая возможность визуализации живого интактного легкого с одноклеточным разрешением в течение до 12 часов.

Начните с того, что привяжите отрезок шовного материала 2-0 длиной три дюйма к трахеальному катетеру, на четверть дюйма выше втулки, используя двойной узел. Затем нанесите глазную мазь на глаза анестезированной мыши и используйте депиляционный крем, чтобы удалить шерсть с левой стороны животного от средней линии грудной клетки до четверти спины и от подмышечной впадины до области чуть ниже ребер. Удалите излишки крема и стерилизуйте открытый участок кожи 70% ethanol.

Затем проведите интубацию животного. Завяжите шовный материал 2-0 вокруг морды, под передними зубами. Переместите животное в зону хирургического вмешательства, стараясь не сместить катетеры, и включите аппарат ИВЛ.

Подключите аппарат ИВЛ к трахеальному катетеру. Затем прикрепите катетер пластырем к морде, а левую переднюю конечность — к катетеру. Убедившись в отсутствии реакции на зажим пальца лапы, с помощью острых ножниц удалите квадратный сантиметр кожи над левой стороной грудной стенки.

Приподнимите молочную жировую подушку и прижгите все открытые кровеносные сосуды. Затем иссеките жировую подушку и удалите мышечный слой до уровня грудной клетки, стараясь не повредить подмышечную вену у основания передней конечности. С помощью пинцета приподнимите шестое ребро.

Затем, удерживая острые ножницы под небольшим углом в пять градусов, перережьте ребро рядом с краем разреза на коже. Удалите четыре последовательных ребра, чтобы расширить отверстие в грудной стенке и полностью обнажить долю легкого. После этого осторожно перенесите мышь на предметный столик микроскопа для визуализации.

При выключенном вакууме заполните внутреннюю камеру вакуумного окна PBS. Переверните мышь и поместите обнаженное легкое над окном покровного стекла для вакуумной визуализации. Медленно включите вакуум.

Поместите фиксирующую привязь, изготовленную из папиросной бумаги, сложенной вдвое, дважды поверх грудной клетки мыши и прикрепите привязь к предметному столику с помощью клейкой ленты. Затем прикрепите пульсоксиметр к лапе животного. После этого установите климатическую камеру на столик и включите подогрев, чтобы поддерживать физиологическую температуру тела мыши.

Когда животное зафиксировано в нужном положении, поднесите объектив с числовой апертурой 25x95 к покровному стеклу. В режиме эпифлуоресценции выберите канал FITC и настройте фокус на ткани легкого. Затем наполните стерильный шприц 100 µL суспензии опухолевых клеток, отсоедините шприц с PBS от катетера хвостовой вены и подключите шприц с опухолевыми клетками.

Медленно введите опухолевые клетки в хвостовую вену. Затем снова подсоедините шприц с PBS к катетеру хвостовой вены и с помощью окуляра микроскопа убедитесь в распределении опухолевых клеток по всей ткани легких. Теперь замените шприц с PBS на шприц, содержащий 100 µL родамин-декстрана, и медленно введите декстран мыши через хвостовой катетер.

После введения декстрана промойте область 50 µL стерильного PBS. Затем получите изображения в каждой из ранее определенных точек расположения опухолевых клеток, чтобы визуализировать кровоток и целостность сосудов. Через двадцать четыре часа после инъекции можно наблюдать взаимодействие отдельных опухолевых клеток с макрофагами и моноцитами внутри сосудов.

Стабильность визуализации позволяет получать последовательные Z-стеки поля обзора и создавать трехмерную реконструкцию. Здесь представлена мозаика из двадцати пяти полей визуализации (сетка 5x5), охватывающая область размером 890 микрон, снятая в течение 205 минут на глубине 15 микрон под поверхностью легкого в области одного метастатического очага через 12 дней после инъекции. Несмотря на большое поле обзора, высокое разрешение исходных кадров, из которых состоит мозаика, позволяет фиксировать субклеточные события, такие как митоз отдельной клетки, что подтверждается разделением хромосом.

Внутрисосудистое введение высокомолекулярного флуоресцентно-меченого декстрана позволяет визуализировать просвет сосудов, однако циркулирующие немеченые эритроциты и лейкоциты могут перекрывать сигнал декстрана. В мелких капиллярах легкого такая окклюзия приводит к мерцанию сигнала декстрана и потере четкости границ сосудов. Высокая пространственная стабильность, обеспечиваемая данным протоколом, позволяет проводить временное усреднение канала крови без размытия изображения, тем самым компенсируя временные окклюзии.

Затем другие сигнальные каналы можно наложить на изображение сосудистой сети, чтобы четко видеть границы сосудов. При должном навыке эта процедура при правильном выполнении занимает около часа. В ходе выполнения данной процедуры важно помнить о необходимости осторожности, чтобы не пересечь крупные кровеносные сосуды без предварительной коагуляции, а также полностью избегать прикосновений к легочной ткани.

После выполнения данной процедуры можно визуализировать самые ранние этапы диссеминации и пролиферации опухолевых клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить прижизненную визуализацию в неповрежденном легком с использованием вакуум-стабилизированного смотрового окна. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.