Патч зажим Запись Starburst амакриновые клетки в плоскопанельных горе Подготовка деафферентированной Mouse Retina

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы выполнить запись клеточного зажима из внутренних нейронов сетчатки в плоском препарате сетчатки мыши. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии сетчатки, такие как разнообразие нейронов, их синаптические связи в норме и при патологии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что сохраняются как вертикальные, так и боковые связи, что позволяет изучать контуры сетчатки с большими боковыми компонентами.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что сетчатка – это тонкая, нежная ткань, с которой нужно обращаться с большой осторожностью и терпением. Практика, однако, является лучшим способом овладеть ею. Чтобы начать эту процедуру, заверните глазные яблоки мыши в чистое бумажное полотенце, чтобы удалить кровь.

Затем погрузите их в карбогенированный раствор Ringer для млекопитающих. Затем проделайте отверстие в лимбе иглой 23-го калибра и рассеките глазные яблоки пополам, разрезав вдоль лимбуса микроножницами. Затем удалите роговицу и хрусталик с помощью тонких щипцов.

Для цельного монтажа сетчатки аккуратно отсоедините всю сетчатку от пигментного эпителия тонкими щипцами и сделайте четыре ортогональных разреза от 1,5 до двух миллиметров от края по направлению к головке зрительного нерва. После этого погрузите в посуду пробитую нитроцеллюлозную мембрану и аккуратно проведите по ней сетчаткой GCL вверх. Затем поместите корешок зрительного нерва в центральное отверстие при подготовке сетчатки целиком.

Впоследствии перенесите мембрану с сетчаткой в другую чистую посуду. Аккуратно расплющите сетчатку как мальтийский крест тонкой кистью для рисования и наложите все четыре края на отверстия. Промокните нитроцеллюлозную мембрану куском сухой фильтровальной бумаги и удалите стекловидное тело и внутреннюю пограничную мембрану с помощью щипцов и малярной кисти.

Убедитесь, что все края сетчатки полностью прикреплены к мембране, прежде чем переносить сборку в камеру записи с помощью герметичного стекла в нижней части. Закрепите мембрану на защитном листе вакуумной смазкой и увлажните сетчатку наружным раствором. Будьте осторожны, чтобы не задержать пузырьки воздуха под сборкой.

Затем установите камеру на столик вертикального микроскопа. Наполните камеру карбогенизированным наружным раствором с температурой 34 градуса Цельсия со скоростью около трех миллилитров в минуту. Сначала исследуйте сетчатку глаза через 10-кратную субъективную линзу.

Затем используйте 60-кратную водную иммерсионную линзу, чтобы увидеть нейроны GCL и INL в режиме DIC и эпифлуоресцентной настройки. Чтобы визуализировать САК tdTomato, используйте белый светодиодный источник света в сочетании с фильтром возбуждения 554 нм и фильтром излучения 581 нм. В этой процедуре внутренний раствор фильтруется через шприцевой фильтр в специальную нить обратной засыпки.

Затем вставьте нить в только что вытянутую микропипетку и дозируйте внутренний раствор возле кончика, пока раствор не покроет серебряную электродную проволоку более чем на пять миллиметров. После этого закрепите микропипетку на держателе электрода с помощью всасывающей тяги, с помощью которой давление внутри электрода можно регулировать, толкая или тяну поршень трубки, подключенной к 10-миллилитровому пластиковому шприцу. Затем расположите пипетку под объективом и опустите ее примерно на 100 микрометров над сетчаткой.

В режиме следителя тока используйте смещение постоянного тока, чтобы обнулить сигнал постоянного напряжения. Измерьте сопротивление пипетки в режиме токового зажима, вводя прямоугольные токи с фиксированной амплитудой через пипетку, когда она находится в ванне. Нейтрализуйте разницу, повернув ручку Raccess, и используйте показания на ней для расчета сопротивления пипетки.

После этого медленно подведите электрод примерно на 10 микрометров выше сетчатки. Приложите положительное давление к электроду. Затем наблюдайте за изменением отражения вокруг кончика пипетки по мере его приближения к сетчатке.

Быстро, но осторожно вдавите пипетку в GCL и немедленно уменьшите положительное давление. Перемещайте пипетку к помеченному нейрону и избегайте контакта с другими нейронами, кровеносными сосудами и кончиками клеток Мюллера. При необходимости приложите больше положительного давления, чтобы предотвратить засорение электродов.

Затем расположите наконечник пипетки рядом с помеченным нейроном, пока не станет видна ямочка. Затем сбросьте положительное давление и дайте плазматической мембране отскочить обратно на наконечник пипетки. Подайте на пипетку отрицательный ток от 20 до 120 пикоампер, чтобы помочь образованию гигаомного уплотнения.

Важно дать клеточной мембране возможность прийти в норму после сброса положительного давления, поскольку для сохранения морфологии клетки после записи важно обеспечить превосходное уплотнение, образующееся естественным образом между мембраной и отверстием пипетки. При необходимости примените мягкое отсасывание, чтобы втянуть плазматическую мембрану в пипетку. Подождите пять минут после формирования уплотнения, чтобы разорвать клеточную мембрану, чтобы обеспечить выведение пролитого внутреннего раствора путем суперфузии.

После разрыва мембраны и нахождения в режиме текущего зажима включите баланс моста и отрегулируйте его с помощью ручки Raccess. Регистрируйте возбуждающие и тормозящие постсинаптические токи в режиме зажима напряжения, удерживая ячейку в положении обратных потенциалов. После записи аккуратно извлеките пипетку из сомы.

Переложите сборку из камеры в чистую посуду. Затем отсоедините и снова прикрепите сетчатку к другой сплющенной нитроцеллюлозной мембране без пробивания отверстий, чтобы обеспечить плоскостность сетчатки во время фиксации. Теперь ткань готова к окрашиванию.

Эти изображения показывают, что холинергические клетки как в GCL, так и в INL могут быть надежно идентифицированы с помощью флуоресценции tdTomato и нацелены на запись целоклеточного патч-клетка в условиях DIC. Колебания их мембранных потенциалов могут быть выявлены путем регистрации токовых клещей, а колебания, вызванные тормозящими и возбуждающими синаптическими токами, выявляются при удержании ячеек при ноль милливольт и отрицательных 75 мВ соответственно в условиях напряжения. Здесь постгистологическая характеристика зарегистрированных клеток указывает на типичную для SAC дендритную морфологию и уровни стратификации в IPL.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости закрепить мембрану сетчатки в записывающей камере и провести регидратацию, не захватывая пузырьки воздуха под ней, плотно и деликатно, чтобы обеспечить пригодный для записи образец. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как запись с двойным патч-клэмпом, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, управляются ли колебания нескольких клеток-мишеней одними и теми же синаптическими механизмами. После своего развития этот метод открывает исследователям в области нейробиологии сетчатки путь к изучению синхронности колебаний между соседними нейронами сетчатки в фоторецепторных дегенерированных сетчатках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как удалить стекловидное тело и подготовить плоское крепление сетчатки для целенаправленной полномасштабной записи патч-хомута с внутренних нейронов сетчатки.