Быстрое приобретение 3D-изображений с помощью высокого разрешения Эпископическое микроскопии

Общая цель этого протокола заключается в быстром получении цифровых 3D-изображений биологических образцов с высоким разрешением с использованием стандартного лабораторного оборудования. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области биологии развития за счет визуализации и динамики сложных морфологических особенностей. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она использует стандартное лабораторное оборудование и требует минимального предварительного опыта.

Демонстрировать процедуру будет Цзюнган Хуанг, аспирант из моей лаборатории. После вскрытия и фиксации эмбриона, как описано в текстовом протоколе, замените фиксатор очищающим раствором и аккуратно поверните образец на коромысле при комнатной температуре в течение одной-двух недель. По окончании инкубации переведите образец в 10%-ный формалин и оставьте на коромысле еще на двое суток.

На третий день промойте пробу в PBS в течение трех пятиминутных стирок. Затем обезвожьте образцы в восходящем ряду этанола при комнатной температуре на мягком качалке в течение двух часов для каждой концентрации. После обезвоживания 100% этанола перенесите образец в раствор для окрашивания на один час, защищенный от света.

Затем замените раствор свежим раствором для окрашивания для ночной маркировки образца. На следующее утро погрузите образец в смесь только что приготовленных растворов для инфильтрации и окрашивания в соотношении один к объему не менее чем на три часа на коромысле при температуре четыре градуса Цельсия. По окончании инкубации перенесите эмбрион в инфильтрационный раствор для еще одной трехчасовой качающейся инкубации.

Затем замените надосадочную жидкость на свежий инфильтрационный раствор еще на три дня качания при четырех градусах Цельсия. На четвертый день сориентируйте эмбрион в закладную форму и поместите форму на лед. Смешайте раствор B с раствором для инфильтрации, а затем осторожно погрузите форму в холодный раствор для встраивания при температуре четыре градуса Цельсия.

Примерно через три часа используйте наконечник, чтобы подтвердить, что раствор застыл, и вытолкните образец из формы. Обрежьте излишки материала для заделки, затем переориентируйте блок образца в новой форме в поперечной ориентации. Далее поместите всю установку на лед в вытяжной шкаф.

Аккуратно добавьте раствор для заделки в новую форму, пока форма не погрузится в воду. Затем поместите держатель блоков на верхнюю часть формы. Через три-четыре часа снимите форму для закладки и поместите блок под стереомикроскоп с косым освещением, чтобы определить положение образца внутри блока.

На грани блока отметьте линии сетки вокруг образца и используйте эти линии в качестве направляющих для обрезки излишков закладного материала. Чтобы получить изображение образца, сначала прижмите блок к микротому, и получите свежий поверхностный срез образца. Затем установите стереозум-микроскоп горизонтально напротив блочной поверхности образца и включите микроскоп и прилагаемый компьютер.

Затем запустите программное обеспечение для получения изображений и используйте режим просмотра в реальном времени в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы сфокусировать оптику на грани блока. При необходимости выровняйте микроскоп и микротом так, чтобы грань блока находилась в центре видоискателя. Одним из наиболее важных этапов этой процедуры является получение изображений в фиксированном домашнем положении микротома.

Отрегулируйте масштаб, чтобы убедиться, что вся грань блока находится в видоискателе. Затем выберите зеленый флуоресцентный белковый фильтр. Продолжайте предварительно резать блок, пока не появится ткань образца, и при необходимости повторно сфокусируйте изображение.

После измерения и настройки времени экспозиции вручную получайте и сохраняйте изображения грани блока после каждого свежего среза, а также записывайте важные параметры получения изображения. В конце сеанса обработки изображений экспортируйте и конвертируйте все файлы изображений в формат JPEG и используйте соответствующее программное обеспечение для обработки изображений для инвертирования всех исходных изображений, регулируя яркость и контрастность изображений по мере необходимости. Загрузите все обработанные изображения в программу для 3D-визуализации, следуя инструкциям.

Выровняйте все изображения в автоматическом режиме и покажите 3D и 2D результаты. На этом репрезентативном изображении всей поверхности эмбриона 15,5-го дня эмбрион мыши подготовлен и изображен так, как только что продемонстрировано. Можно наблюдать подробные морфологические особенности кожи, включая подушечки усов и развивающиеся волосяные фолликулы.

Важно отметить, что разрешение виртуального среза образца эмбриона на 15,5-й день, полученного с помощью этого метода, аналогично стандартному гистологическому срезу. После освоения вся процедура после предварительной обработки очищающим раствором может быть завершена за одну неделю, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что красящий раствор должен быть защищен от света на уровне четырех градусов во время инфильтрации и этапа внедрения.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как чешуйчатое окрашивание, чтобы ответить на дополнительный вопрос о специфических моделях распределения типов клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать лабораторное оборудование для получения 3D-изображений биологических образцов с высоким разрешением для их морфометрического анализа. Не забывайте, что работа с фиксирующими, окрашивающими и инфильтрационными растворами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу и ношение перчаток.