подготовки и

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать синтез зонда на основе активности ARN 14686, специфичного для N-ацилэтаноламинокислотной амидазы (NAAA), и описать его использование для обнаружения каталитически активного фермента в клеточных экстрактах и срезах тканей. Этот метод может помочь ответить на вопросы о функции NAAA in vivo, предоставляя сведения об активации NAAA при различных физиологических и патологических состояниях, таких как воспалительные и нейродегенеративные заболевания. Его основным преимуществом является то, что после реакции NAAA с зондом требуется простая манипуляция, что позволяет получить достоверную информацию о состоянии активации фермента in vivo.

Еще одним преимуществом является то, что, в отличие от специфических антител, наш зонд детектирует только активную форму фермента, что полезно для определения статуса методом флуоресцентной микроскопии. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как она объединяет различные области знаний, которые складываются в единую последовательность действий — от правильного синтеза до окончательного применения. В круглодонной колбе объемом 50 мл растворите 350 мг ундецинола и 3,5 мл сухого дихлорметана.

Затем добавьте в этот раствор 25 milligrams DMAP и 530 milligrams DPC. Перемешивайте смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Через 16 часов добавьте в раствор 20 milliliters дихлорметана.

Перенесите смесь в делительную воронку. Добавьте 15 milliliters воды. Встряхните смесь и дайте двум фазам разделиться.

Затем откройте кран, соберите органическую фазу из нижней части, закройте кран и перенесите органическую фазу обратно в делительную воронку. Добавьте к смеси 15 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Встряхните делительную воронку и дайте двум фазам разделиться.

После высушивания органического слоя сульфатом натрия профильтруйте его через ватный тампон в многогорлую круглодонную колбу. Затем выпарите органический слой досуха при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Взвесьте колбу и получите 600 mg масла, представляющего собой смесь пиридил-ундецинил карбоната и ундецинол-ди-оксипиридинкарбоксилата в соотношении 1,7:1.

В круглодонной колбе объемом 10 мл растворите 60 мг оксоацетиденола аммония ацетата в 2 мл сухого дихлорметана. Охладите раствор до 0 °C на ледяной бане, затем по каплям добавьте 81 мкл диазапропалэтиламина. Далее растворите 350 мг сырой смеси, содержащей ундецинол-2-оксипиридинкарбоксилат, в 2 мл сухого дихлорметана.

Добавьте растворенную смесь к раствору и перемешивайте при комнатной температуре в течение 15 часов. Затем выпарите растворитель досуха при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Очистите соединение методом колоночной хроматографии на силикагеле, используя автоматический аппарат для колоночной хроматографии.

Сначала адсорбируйте образец на силикагеле. После уравновешивания колонки циклогексеном внесите образец в картридж. Элюируйте образец этилацетатом в циклогексане в градиенте от 0 до 100%, собирая пики в пробирки.

Испарите растворитель из фракций, соответствующих соединению, досуха при пониженном давлении с помощью роторного испарителя, чтобы получить 40 mg белого твердого вещества. После предварительной очистки образца, как описано в текстовом протоколе, добавьте 11.3 µL стокового раствора азидо-полиэтиленгликоль-биотина с концентрацией 5 mM и перемешайте на вортексе. Затем добавьте в образец 11.3 µL свежеприготовленного стокового раствора TCEP с концентрацией 50 mM и перемешайте на вортексе.

После предварительного смешивания 34 µL свежеприготовленного рабочего раствора TBTA с концентрацией 1,7 мМ и 11,3 µL стокового раствора сульфата меди с концентрацией 50 мМ, добавьте 45,3 мл этого раствора к образцу и перемешайте на вортексе. Используйте маркированные контейнеры. Инкубируйте реакционную смесь при 25 °C не менее двух часов.

После одного часа инкубации проследите за осаждением белка и перемешайте реакционную смесь. Центрифугируйте образец в течение четырех минут при 6, 500 ×g и температуре четыре °C. После удаления супернатанта добавьте 750 µL холодного метанола и ресуспендируйте осадок путем соникации с использованием ультразвукового зонда в течение пяти секунд.

Затем центрифугируйте образец в течение четырех минут при 6 500 ×g при температуре четырех градусов Цельсия. Удалите супернатант с помощью шприца с иглой. После еще двух промывок холодным метанолом добавьте к протеиновому осадку 325 µL 2,5 % SDS в PBS.

Обработайте образец ультразвуком трижды по пять секунд. Затем нагрейте образец в течение пяти минут при 65 °C. После ультразвуковой обработки центрифугируйте образец в течение пяти минут при 6 500 ×g при комнатной температуре.

Затем перенесите супернатант в чистую пробирку объемом 15 мл и добавьте к супернатанту 1,4 мл PBS, чтобы разбавить концентрацию SDS до 0,5%. Для обогащения стрептавидином сначала доведите объем образца с помощью PBS до 4,2 мл. Затем с помощью наконечника с обрезанным концом добавьте 40 мкл 50% суспензии предварительно промытого стрептавидин-агарозового сорбента.

Инкубируйте смесь в течение двух часов при комнатной температуре с перемешиванием (вращением). После центрифугирования в течение двух минут при 1 400 ×g удалите супернатант, не допуская высыхания осадка гранул. Используйте остатки супернатанта для переноса гранул в спин-колонку объемом 1 мл и промойте колонку методом гравитационного осаждения 1 мл 1% SDS в PBS.

Продолжайте промывать гранулы 6 M мочевиной, а затем PBS, как описано в текстовом протоколе. Затем используйте 500 µL PBS для переноса промытых гранул в пробирку объемом 1,5 мл. После центрифугирования образца в течение двух минут при 1 400 ×g осторожно аспирируйте супернатант с помощью шприца и иглы.

Для элюции белков, связанных с смолой, добавьте 25 µl элюирующего буфера к осадку смолы и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем в течение 15 минут при 95 °C. Добавьте приблизительно 400 µl смеси для клик-химии к срезам ткани, приготовленным в соответствии с текстовым протоколом. Убедитесь, что выбранный объем смеси для клик-химии достаточен для полного покрытия срезов.

Затем инкубируйте срезы ткани в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. После инкубации промойте образцы раствором PBS в течение пяти минут, а затем холодным метанолом в течение пяти минут. Далее трижды промойте срезы ткани раствором 1% Tween 20 и 0,5 mM EDTA в PBS по две минуты.

Наконец, промойте срезы с PBS еще раз в течение пяти минут. После высушивания на воздухе добавьте каплю средства для заключания с DAPI и антифейдинговым агентом. Накройте образцы покровными стеклами и загерметизируйте лаком.

Для синтеза зонда ундецинол активируют дипиридилкарбонатом в присутствии каталитического количества 4-диметиламинопиридина для получения смешанного карбоната, который затем вводят в реакцию с аминолактамом; бета-лактам или «головка» зонда взаимодействует с активным центром NAAA, в то время как терминальный алкин может быть функционализирован репортерной меткой с помощью клик-химии. ARN 14686 использовали для детектирования активации NAAA в клеточных экстрактах воспаленных лап крыс методом белковой блокады. У наивных крыс сигнал NAAA не обнаруживается.

Напротив, у крыс, получавших полный адъювант Фройнда, наблюдается выраженная полоса, соответствующая активной NAAA. Другим применением ARN 14686 является визуализация тканей с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь красным цветом обозначены альвеолярные макрофаги, положительные по активной NAAA.

NAAA локализована в диффузных везикулярных структурах, что отчетливо видно при большем увеличении. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать и использовать ARN 14686 для обнаружения активной NAAA в тканях с помощью вестерн-блоттинга и флуоресцентной микроскопии. Кроме того, хотя данный протокол специфичен для нашей мишени, описанные методы применения зонда могут быть легко адаптированы для других зондов на основе активности, специфичных для мишеней, отличных от NAAA.