Простой механический Процедура создания лимбальных Дефицит стволовых клеток у мышей
17 ноября 2016 г.
В следующей статье дается легко воспроизводимый метод для эффективного создания устойчивой модели мыши дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD). Эта модель животных полезна при тестировании и сравнения эффективности лечения заболеваний лимбальных стволовых клеток.
Общая цель этой процедуры заключается в создании воспроизводимой, устойчивой и стойкой мышиной модели дефицита лимбальных стволовых клеток. Этот простой метод обеспечивает последовательную животную модель дефицита лимбальных стволовых клеток, не вызывая нежелательного повреждения глаза, чего трудно достичь с помощью стандартных моделей химических повреждений. Эта модель полезна для изучения патологического процесса в долгосрочной перспективе на клеточном и молекулярном уровне.
А также для тестирования или сравнения эффективности новых методов лечения. После обезболивания мыши защемите палец ноги, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии. Осмотрите глаз под щелевым фонарем, чтобы убедиться в отсутствии каких-либо предыдущих повреждений роговицы.
Закапайте в глаз каплю 1% тетракаина гидрохлорида и подождите 60 секунд. Далее аккуратно нанесите 5% повидон-йод на глаз и волосы вокруг него. Через минуту сотрите каплю или распределите ее по волосам вокруг глаза, чтобы волосы не мешали кончику инструмента.
Подготовьте стерильный вращающийся бор и пару стерильных изогнутых пинцетов, и держите их на стерильном листе во время процедуры. Теперь стабилизируйте глаз, взявшись за веки со стороны носа с помощью согнутого пинцета и осторожно проктозив глаз. Будьте осторожны и не оказывайте слишком большого давления.
Под операционным микроскопом дважды побрейте область лимбалы с помощью стерильного вращающегося заусенца. Удалите весь эпителий роговицы от лимба к лимбу с помощью вращающегося заусенца по кругу и работайте с боковой стороной его кончика. Во избежание травмирования стромы не проводите повторную чистку частей роговицы, из которых был удален эпителий.
Не давите на глаз. При необходимости очистите кончик щетки. Нанесите каплю стерильного PBS на роговицу и сотрите все отслоившиеся эпителиальные листы мягкой чистящей салфеткой.
Затем сбрейте оставшийся эпителий, если он есть. Обратите внимание на хвост мыши, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии во время операции. Нанесите каплю Флуоресцеина натрия на роговицу.
Очистите роговицу через 30 секунд и осмотрите ее под микроскопом с кобальтовым синим фильтром, чтобы убедиться в полном удалении эпителия. После процедуры поместите животное в клетку на одеяло с подогревом и наблюдайте за ним в течение 30-45 минут до полного восстановления от наркоза. Тем временем нанесите на глаз 1%-ную офтальмологическую мазь Erythromycin и продолжайте применение антибиотика ежедневно в течение недели.
Кроме того, введите 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно сразу и через 12 часов после процедуры, и продолжайте инъекцию два раза в день в течение двух дней. Это фенотип роговицы через месяц после процедуры. Вы можете увидеть обширную неоваскуляризацию, которая является признаком дефицита лимбальных стволовых клеток.
Нормальная роговица экспрессирует цитокератин 12, но лишена цитокератина 8 или бокаловидных клеток. При дефиците лимбальных стволовых клеток на роговице появляются Цитокератин 8 и бокаловидные клетки, в то время как Цитокератин 12 теряется. После освоения этой техники неоваскуляризация роговицы приведет к неоваскуляризации роговицы, которая покроет почти всю поверхность роговицы мыши в течение одного месяца и будет стабильной до трех месяцев.
Важно избегать повторной чистки зубов на тех участках роговицы, которые уже были удалены. Это может вызвать нежелательное воспаление стромы и помутнение. После развития дефицита лимбальных стволовых клеток можно протестировать и сравнить экспериментальные методы лечения.
В качестве альтернативы лечение может быть начато вскоре после травмы. В этом видео показано, как эффективно удалить лимбальный и роговичный эпителий для индуцирования дефицита лимбальных стволовых клеток у мышей. С некоторыми модификациями его можно выполнять и на других животных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен воспроизводимый метод создания устойчивой модели дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD) у мышей. Эта модель необходима для изучения патогенеза заболевания и тестирования новых методов лечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Офтальмология
Теоретические сведения
- Дефицит стволовых клеток лимба влияет на здоровье роговицы и зрение.
- Современные модели часто вызывают нежелательные повреждения, что затрудняет исследования.
- Для долгосрочных исследований необходима устойчивая модель.
- Данная методика направлена на устранение этого пробела.
Цель исследования
- Разработать стабильную мышиную модель LSCD.
- Обеспечить возможность изучения клеточных и молекулярных патологических процессов.
- Оценить эффективность потенциальных методов лечения.
Используемые методы
- Мыши вводят анестетик.
- Глаз осматривают с помощью щелевой лампы на предмет имеющихся повреждений.
- Для индукции LSCD без нанесения дополнительных повреждений применяется специальный метод.
- Проводится долгосрочный мониторинг состояния модели.
Основные результаты
- Модель успешно имитирует LSCD без нежелательного повреждения глаза.
- Она позволяет проводить долгосрочные клеточные и молекулярные исследования.
- С помощью этой модели можно эффективно тестировать новые методы лечения.
- Результаты свидетельствуют о надежности метода для дальнейших исследований.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследования LSCD.
- Он расширяет понимание заболеваний лимбальных стволовых клеток.
- Будущие исследования могут основываться на этой модели для совершенствования методов лечения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Создание воспроизводимой мышиной модели дефицита лимбальных стволовых клеток (ДЛСК) отвечает критической потребности в биологических системах, релевантных заболеванию, для разработки офтальмологических препаратов. Данная модель позволяет снизить риски за счет изучения механизмов патогенеза и повысить прогностическую достоверность при доклинической оценке регенеративных и противовоспалительных методов терапии нарушений роговицы. Стабильность фенотипа и трансляционная сопоставимость этой модели обеспечивают эффективное продвижение разработок по технологическому циклу и сравнимость результатов между различными программами исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать функции лимбальных стволовых клеток и пути регенерации роговицы.
- Способствует снижению биологических рисков за счет создания воспроизводимой модели заболевания с контролируемым повреждением.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для потенциальных терапевтических средств при LSCD.
- Повышает прогностическую достоверность трансляционной значимости исследований заболеваний поверхности глаза.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную платформу in vivo для количественной оценки терапевтической эффективности.
- Обеспечивает стандартизированную оценку клеточных и молекулярных конечных точек, таких как экспрессия цитокератинов и неоваскуляризация.
- Поддерживает воспроизводимый и масштабируемый скрининг новых соединений или биологических препаратов для восстановления роговицы.
- Способствует достоверному сравнению различных методов лечения в контролируемых условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует патологии LSCD у человека, что способствует разработке трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации стратегий регенерации.
- Обосновывает решения о продвижении разработок средств терапии глазных заболеваний при дефиците стволовых клеток с учетом рисков.
- Предоставляет понимание механизмов прогрессирования заболевания и терапевтического ответа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель LSCD интегрируется в континуум от поиска до доклинических исследований, позволяя тестировать гипотезы, идентифицировать перспективные соединения и проводить трансляционную валидацию методов терапии поверхности глаза.
- Открывающая биология: Обеспечивает возможность проведения исследований по проверке гипотез о потере лимбальных стволовых клеток и механизмах восстановления роговицы.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные данные для оценки эффективности и безопасности потенциальных терапевтических средств.
- Аналитика: Обеспечивает измерение молекулярных маркеров (например, профилей цитокератинов) и степени неоваскуляризации для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Позволяет связать доклинические данные с клинической практикой путем моделирования стойких фенотипов LSCD.
- Корпоративное использование: Предлагает стандартизированную, адаптируемую платформу для межпрограммной оценки средств терапии заболеваний глаз.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов действия при разработке офтальмологических препаратов.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость доклинических исследований LSCD.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала для офтальмологических портфелей.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков и продвигать регенеративные и противовоспалительные препараты-кандидаты.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области офтальмологической хирургии мелких животных и послеоперационного ухода.
- Необходим доступ к хирургическим микроскопам, моторизованным борам и инструментам для молекулярного анализа.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов индукции повреждения и оценки фенотипа.
- Метод может быть адаптирован для других моделей мелких животных с внесением соответствующих модификаций в процедуру.
- Для предотвращения повреждения стромы и обеспечения воспроизводимости модели крайне важна тщательная техника выполнения.
